管碟法測定抗生素效價詳解

1、抗生素微生物測定法,一、概述,1.抗生素的概念及抗生素的生物檢定 抗生素是由微生物所產(chǎn)生的極微量便具有選擇性地殺死或抑制其他病原微生物生長的一類天然有機化合物。 抗生素的生物檢定是以抗生素對微生物的抗菌效力作為效價的衡量標(biāo)準(zhǔn)。,2.抗生素的效價和單位 抗生素的含量用效價和單位表示。該詞有時不加區(qū)別統(tǒng)稱為效價單位。 效價（ｐotency），指檢品的實際

2、單位數(shù)與其標(biāo)示量的比值。常表示為效價的百分?jǐn)?shù)。 單位（unit,u）單位是衡量抗生素有效成分的具體尺度。,（１）重量單位 以抗生素的生物活性部分重量作單位１微克（ｕｇ）＝１單位，１毫克＝１０００單位。（２）類似重量單位 以特定的純粹抗生素鹽類的重量作為１單位。如純粹金霉素鹽酸鹽及四環(huán)素鹽酸鹽（包括無生物活性的鹽酸根在內(nèi)）１微克（ｕｇ）＝１單位，１毫克＝１０００個單位。這是根據(jù)國際使用習(xí)慣而來的。（３）

3、質(zhì)量折算單位 以特定的純抗生素鹽的質(zhì)量為單位而加以折算。青霉素0.6ug為1單位（４）特定單位 以特定的抗生素標(biāo)準(zhǔn)品的某一質(zhì)量定為一單位。,管碟法濁度法,抗生素微生物檢定法,1、管碟法：是利用抗生素在攤布特定試驗菌的固體培養(yǎng)基內(nèi)呈球面形擴散，形成含有一定濃度抗生素球形區(qū)，抑制了試驗菌的繁殖而呈現(xiàn)出的透明抑菌圈。此法系根據(jù)抗生素在一定濃度范圍內(nèi)，對數(shù)劑量與抑菌圈面積呈線性關(guān)系，通過比較 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品產(chǎn)生抑菌 圈的大小

4、，計算出供試品 的效價。,,2、濁度法系利用抗生素在液體培養(yǎng)基中對試驗菌生長的抑制作用，通過測定培養(yǎng)后細菌濁度值的大小，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品對試驗菌生長抑制的程度，以測定供試品效價的一種方法。,管碟法測定抗生素效價原理和方法,一、 原理 在一定的抗生素濃度范圍內(nèi)，對數(shù)劑量(濃度)與抑菌圈的表面積或直徑成正比，可以得出一條曲線。 抗生素濃度換算成對數(shù)，則抑菌圈直徑與抗生素對數(shù)成直線關(guān)系,2.原理－抑

5、菌圈的形成,兩種互動作用：一種是抗生素溶液向培養(yǎng)基內(nèi)呈球面狀擴散作用；另一種是試驗菌的生長作用。當(dāng)培養(yǎng)到一定時間，瓊脂培養(yǎng)基中的兩種互動作用達到動態(tài)平衡時，瓊脂培養(yǎng)基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因抗生素濃度高于抑菌濃度，試驗菌生長受到抑制，此處瓊脂培養(yǎng)基成透明狀；在抑菌圈邊緣抗生素濃度恰好等于抗生素最低抑菌濃度。,一、試驗前準(zhǔn)備,雙碟的挑選,內(nèi)徑約90mm，硬質(zhì)玻璃或塑料培養(yǎng)平皿，水平透明，無色斑氣泡,物品的清洗、滅菌,培養(yǎng)皿

6、、鋼管、刻度吸管清洗后160℃干熱滅菌2小時或121℃高壓蒸汽滅菌30min，放置室溫備用；陶瓷瓦蓋要定期清洗干燥。,牛津杯的挑選,內(nèi)徑（6.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm，外徑（7.8±0.1）mm，重量差異不超過±0.01g，光潔平坦,緩沖液的制備,磷酸鹽緩沖液（pH6.0） 取磷酸氫二鉀2g與磷酸二氫鉀8g，加水使成1000ml，濾過。磷酸鹽緩沖液（pH7.0） 取磷酸氫二鈉

7、（Na2HPO4*12H2O）9.39g與磷酸二氫鉀3.5g，加水使成1000ml，濾過。磷酸鹽緩沖液（pH7.8） 取磷酸氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀0.41g，加水使成1000ml，濾過。,基本要點 ： ① 高劑量抗生素溶液所形成的抑菌圈直徑在18～22mm； ② 高、低劑量所形成的抑菌圈之差最好大于2 mm，有些抗生素的差數(shù)可較小； ③ 高、低劑量之比一般用2:1，當(dāng)高、低劑量所致的抑菌圈差別較小時，可用高低劑量之比為4:1的比

8、率。,,儀器與用具1 . 操作室2. 雙碟 3. 陶瓦蓋　　4. 鋼管 5. 鋼管放置器6. 恒溫培養(yǎng)箱 7. 滅菌刻度吸管 8. 玻璃容器 9. 稱量瓶 10.毛細滴管或可調(diào)式移液器（1～1000μl) 　11.天平12.抑菌圈(直徑)測量儀。13.超凈工作臺　用于菌種的接種或傳代。超凈工作臺須置潔凈工作室或半無菌室內(nèi)。,檢定菌的來源：檢定菌種由中監(jiān)所所提供

9、的冷凍干燥品。    檢定菌的傳代和接種：  芽胞桿菌3～6個月（其他細菌每個月）用普通瓊脂斜面?zhèn)鞔?次，將新傳代的培養(yǎng)物代替原有的菌種，作為工作用（陽性對照）菌種。傳代和接種在菌種接種室內(nèi)按無菌操作要求進行。,冷凍菌種安瓶的接種。 用75%酒精棉擦凈菌種安瓿的外壁，稍干。 點燃酒精燈，將安瓿的封口，一端在火焰上燒灼紅熱用毛細管吸取滅菌水少許在灼熱處，使其驟冷而炸裂，另

10、取1支滅菌毛細滴管，在火焰旁吸取少量滅菌水，加至菌種管底部，將凍干菌塊攪動促使溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，分別接種至營養(yǎng)瓊脂斜面，將營養(yǎng)瓊脂斜面瓊脂斜面于37℃恒溫培養(yǎng)24小時。,管碟法的操作步驟,預(yù)試驗→試驗準(zhǔn)備→ 雙碟底層的制備→ 供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備→菌層的制備→滴加抗生素溶液→雙碟的培養(yǎng)→ 抑菌圈的測量→結(jié)果的可靠性檢驗及效價測定,預(yù)試驗： 確定最佳的試驗條件：調(diào)整試驗菌的濃度、使用量、抗生素終濃度、培養(yǎng)

11、基等，使抑菌圈的大小符合規(guī)定：高劑量濃度溶液所致的抑菌圈直徑在18～22mm。高劑量與低劑量的抑菌圈直徑之差最好不小于2mm。高低劑量之比為2:1（如高、低劑量所致的抑菌圈差別較小時，可用4:1的劑量比率）。,,試驗準(zhǔn)備： 雙碟、鋼管、毛細滴管、吸管的清洗及滅菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培養(yǎng)基、緩沖液的準(zhǔn)備、半無菌間的紫外消毒等。,,供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備： 估計供試品的效價，根據(jù)試驗要求設(shè)計供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋步

12、驟，平行制備供試品、標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)劑量的溶液。,,,1. 稱量 稱量前，將標(biāo)準(zhǔn)品從冰箱取出，使與溫室平衡；供試品應(yīng)放于干燥器內(nèi)至少30min方可稱取。供試品與標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用同一天平；吸濕性較強的抗生素，在稱量前1～2ｈ更換天平內(nèi)干燥劑。標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的稱量最好一次取樣稱取，不得將已取出的標(biāo)準(zhǔn)品或供試品倒回原容器內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)品稱量不可少于20mg，取樣后立即將稱量瓶及被稱物蓋好，以免吸水。樣品的稱樣量最好不少于50mg。,2. 稀釋 稀釋操作

13、應(yīng)遵照容量分析的操作規(guī)程?！谋渲腥〕龅臉?biāo)準(zhǔn)溶液，必須先在室溫放置，使其溫度達到室溫后，方可量取。標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液的稀釋應(yīng)采用容量瓶，每步稀釋，取樣量不得少于2ml為宜，稀釋步驟一般不超過3步。舉例：取濃溶液1000u/ml。第一步取5ml（1000U/ml）→50ml容量瓶→100U/ml；第二步取5ml（100u/ml）→50ml容量瓶→10U/ml（H）；取5ml（100U/ml）→100ml容量瓶→5U/ml（L）?！∶?/p>

14、次吸取溶液用刻度吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管2～3次，吸取樣品溶液后，用濾紙將外壁多余液體擦去，從起始刻度開始放溶液。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與供試品用的緩沖液應(yīng)同一批和同瓶，以免因pH或濃度不同影響測定結(jié)果。稀釋時，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液體完全流下，再準(zhǔn)確補加至刻度。,3． 雙碟的制備 在半無菌室內(nèi)進行，應(yīng)注意微生物及抗生素的污染，培養(yǎng)基應(yīng)在水浴中或微波爐中融化，避免直火加熱?！　〉讓樱河脺缇罂谖埽?0ml

15、）或其他滅菌分裝器，吸取已融化的培養(yǎng)基20ml注入雙碟內(nèi)，等凝固后更換干燥的陶瓦蓋，放于35～37℃培養(yǎng)箱中保溫，使易于攤布菌層?！　【鷮?取出試驗用菌懸液，按已試驗妥的菌量[按(2.2)法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在18～22mm；用滅菌吸管吸取菌懸液加入已融化并保溫在水中(一般細菌48～50℃，芽孢可至60℃)的培養(yǎng)基內(nèi)，搖勻作為菌層用。用滅菌大口10ml吸管或其他分裝器，吸取菌層培養(yǎng)基5ml，使均勻攤布在底層培養(yǎng)基上，置

16、水平臺上并用陶瓦圓蓋覆蓋，放置20 ～ 30min，待凝固，備用。,4．放置鋼管 用鋼管放置器，將干熱滅菌的鑷子或適宜方法將鋼管裝于玻璃管中，放于鋼管放置器上，將雙碟打開，放入雙碟臺上，托起雙碟臺，使鋼管平穩(wěn)落在培養(yǎng)基上，注意使各個鋼管下落的高度基本一致，鋼管放妥后，雙碟靜置5～10 min,使鋼管在瓊脂內(nèi)稍下穩(wěn)定后，再開始加抗生素溶液?！?．滴加抗生素溶液　　每批供試品取6~10個雙碟，滴加溶液可調(diào)式移液器，在滴加之前須用滴加液

17、洗2~3次。滴加溶液的順序:SH→TH→SL→TL。滴加溶液至鋼管口平滿，注意滴加溶液間隔不可過長，因溶液的擴散時間不同影響測定結(jié)果。,二劑量法（2 ? 2法）：用標(biāo)準(zhǔn)品、供試品各兩個劑量，根據(jù)量反應(yīng)平行線原理，在相同試驗條件下，比較標(biāo)準(zhǔn)品和供試品二者對微生物產(chǎn)生的效力。二劑量法用于抗生素藥品效價的常規(guī)測定；,雙碟底層的制備： 每只雙碟加底層培養(yǎng)基約20ml，待培養(yǎng)基凝固，待用。,,菌層的制備： 菌層培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中添

18、加一定量的菌懸液，振搖混勻。注意菌層培養(yǎng)基溫度；根據(jù)預(yù)試驗確定加入菌層培養(yǎng)基的菌液量。 每只雙碟加入5ml菌層培養(yǎng)基。 注意制備菌層的速度和平整度。,,待菌層凝固干燥15min左右，放置鋼管，待鋼管自然沉降15min后，按SH→TH→SL→TL順序滴加藥液。,滴加抗生素溶液：,,,注意標(biāo)準(zhǔn)品、供試品高、低劑量溶液滴加順序，保證滴加速度和加量的均勻一致。每組雙碟至少為8個，一般為10個。,在每個雙碟的4個鋼管中，對角的兩個

19、鋼管分別滴加高濃度和低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其余兩個對角位置的鋼管分別滴加相應(yīng)的高、低濃度的供試品溶液。,按SH→TH→SL→TL順序，分別滴加標(biāo)準(zhǔn)品和供試品高、低劑量溶液。,雙碟的培養(yǎng)： 根據(jù)培養(yǎng)溫度的要求在培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中水平疊放的雙碟數(shù)以不超過三層為宜。,,抑菌圈的測量： 將培養(yǎng)好的雙碟取出，打開陶瓦蓋，將鋼管倒入1：1000新潔爾滅溶液或其他消毒液內(nèi)浸泡，檢查抑菌圈是否圓整，如有破圈或不圓整圈應(yīng)將碟棄去，切

20、忌主觀挑選抑菌圈和雙碟，是結(jié)果造成偏離。 抑菌圈測量儀的使用：每組試驗雙碟應(yīng)在相同的測量參數(shù)下進行測量。,,結(jié)果的可靠性檢驗及效價測定： 抑菌圈測量儀提供計算結(jié)果或手工計算結(jié)果。,記錄與計算　1. 試驗記錄 應(yīng)包括抗生素的品種、劑型、標(biāo)示量、生產(chǎn)廠、批號、檢查目的、檢驗依據(jù)、檢驗日期、溫度、濕度，標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的稱量、稀釋步驟與核對人，抑菌圈測量結(jié)果。當(dāng)用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑時，應(yīng)將測試數(shù)據(jù)以框圖方式順雙碟數(shù)記錄

21、。當(dāng)用測量儀測量面積或直徑時，應(yīng)將電腦測試、計算、統(tǒng)計分析的打印紙貼附于記錄中?！?. 計算注意事項：a、濃度比不等于1.000時，如標(biāo)準(zhǔn)品溶液（S）d的濃度為1005u/ml,而供試品溶液(T)的濃度995u/ml，D=S/T=1.0101；也可將D值設(shè)為1.000，而估計效價設(shè)為101.01%b、所測定的實際效價應(yīng)在D值與估計效價乘積的90%和110%范圍內(nèi)，超出就應(yīng)重新估計效價。如估計效價為100%，D=1.000，而測得的效

22、價為115%，按110%重估效價再進行試驗。C、原料及不合格供試品，進行平行試驗，配置兩份標(biāo)準(zhǔn)品和兩份供試品，一份標(biāo)準(zhǔn)品與一份供試品為一組滴樣,結(jié)果判斷　1.　可靠性測驗結(jié)果認為可靠，方可進行效價和可信限率計算?！?.可信限率　考核實驗的精密度，除藥典各論另有規(guī)定外，本法的可信限率不得超過5%。上述各項規(guī)定都能符合者，試驗結(jié)果成立?！?. 實驗計算　所得效價低于估計效價的90%或高于估計效價的110%，則檢驗結(jié)果僅作為初試，應(yīng)調(diào)

23、整供試品估計效價，予以重試?！?. 效價測定　一般需雙份樣品，平行實驗以便核對。對不符合規(guī)定的樣品應(yīng)至少有2次符合規(guī)定的結(jié)果，才能發(fā)出報告。,克服常見的一些影響因素,1. 實驗器材的準(zhǔn)備 1.1 實驗器材的選擇試驗應(yīng)該選擇底面平整的玻璃雙碟，避免底面的凹凸影響瓊脂層的厚度?？蓪㈦p碟放置在水平臺上，下墊一層白紙，加入3mL水，再滴加藍墨水，根據(jù)藍色是否深淺一致來判斷雙碟底面平整程度。小鋼管則應(yīng)該選擇加工精細的

24、同一批產(chǎn)品，這樣才能保證管壁厚薄與重量均勻一致，使得小鋼管在培養(yǎng)基中下陷相同的深度，抗生素溶液擴散均勻有可比性。如果小鋼管兩端不夠平，就應(yīng)予剔除，否則會使抗生素溶液漏出，破壞均勻擴散現(xiàn)象,,1.2 實驗器材的清洗 抗生素試驗中，玻璃雙碟、小鋼管往往會連續(xù)使用。由于清洗方面的原因，它們還是容易殘留上次試驗中的抗生素（慶大霉素、爭光霉素、鏈霉素等）或者被清洗用的殺菌劑（如新潔而滅、洗潔精等）污染，以至于在下次試驗中造成抑菌圈不正常的現(xiàn)象。

25、因此，在清洗時要尤為注意多用流水沖洗。160℃干熱滅菌2h后備用。,2. 配制試驗所需的樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、緩沖液與培養(yǎng)基 2.1 樣品與標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品從冰箱取后，使與室溫平衡。稱量最好為一次取樣稱量，動作迅速，不得反復(fù)稱取，取樣后立即將稱量瓶瓶蓋蓋好，以免吸水。標(biāo)準(zhǔn)品的稱量最好用1/100,000克的分析天平，樣品稱量不得低于1/10,000克的分析天平。天平中的干燥劑應(yīng)保持經(jīng)常注意更換。稱量結(jié)束后，加入磷酸緩沖液，

26、定容至刻度，過濾并稀釋。稀釋時，都應(yīng)采用容量瓶，每一步稀釋取樣量不得少于2mL。用刻度吸管吸取溶液前，要用待稀釋液沖洗吸管2～3次，吸取溶液后，要用濾紙把刻度吸管外壁多余液體擦去，再從起始刻度開始放溶液。在稱量抗生素樣品過程中，操作者的工作服上有可能會沾染抗生素粉末，在配培養(yǎng)基、加底層培養(yǎng)基、加菌層培養(yǎng)基或滴加抗生素溶液時，會隨衣袖的抖動落入培養(yǎng)基，造成破圈或者無抑菌圈。所以配制抗生素溶液應(yīng)單獨使用一套工作服。,2.2 培養(yǎng)基與緩沖液的

27、配制 配制培養(yǎng)基與緩沖液時要按照配比用量，配制后調(diào)節(jié)其pH值。因為在pH值、鹽濃度的影響下，即使瓊脂培養(yǎng)基上的兩個相鄰的小管距離足夠，還是可能會出現(xiàn)卵圓形抑菌圈。例如四環(huán)素易受pH值影響，鏈霉素易受鹽濃度影響。培養(yǎng)基可以購買廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品，因為大批量產(chǎn)品中的成分配比較穩(wěn)定，可比性較強。,,3. 加注培養(yǎng)基 3.1 加注底層培養(yǎng)基無菌室工作臺面可能因為使用時間已久，變得凹凸不平或者傾斜，會影響培養(yǎng)基菌層的厚度均勻性。菌層越薄，形成

28、的抑菌圈越大，會給試驗造成很大的誤差。我們可以在桌面上放置一塊足夠大的玻璃平板，保證雙碟放置區(qū)域的平整。試驗中加注的培養(yǎng)基如果溫度太低，就容易在內(nèi)部結(jié)塊，或者加注到雙碟之后不能及時鋪開，使得培養(yǎng)基表面為非水平面，會給試驗帶來誤差。加注60～65℃的培養(yǎng)基底層之后，不應(yīng)立即給雙碟加蓋。因為溫度過高的培養(yǎng)基會形成大量的水蒸氣，在雙碟蓋上凝集并滴落在已經(jīng)凝固定的培養(yǎng)基底層上，會給培養(yǎng)基菌層的加注帶來影響。,,3.2 加注培養(yǎng)基菌層制備瓊脂培養(yǎng)

29、基菌層時，培養(yǎng)基溫度過高或者受熱時間太長都會導(dǎo)致試驗菌死亡。當(dāng)菌種為非芽孢桿菌的時候，現(xiàn)象尤為明顯，甚至?xí)霈F(xiàn)無菌生長。因此，培養(yǎng)基應(yīng)放在50℃水浴中保溫。當(dāng)加入試驗菌種混勻后，應(yīng)盡快加注到底層培養(yǎng)基上。在試驗的時候，如果從大瓶內(nèi)用刻度吸管吸取帶菌培養(yǎng)基，吸管中培養(yǎng)基量少極易冷卻，加在底層培養(yǎng)基上就不易均勻鋪開，導(dǎo)致菌層厚度不均，影響到抑菌圈的直徑。,,4. 放置小鋼管時，注意管與管之間不能太靠近，否則會引起相鄰的兩個抑菌圈之間的抗生素

30、擴散區(qū)中的濃度增大，相互影響形成卵圓形或橢圓形抑菌圈。管與雙碟邊緣同樣也不能太靠近，因為液面浸潤作用，邊緣的瓊脂培養(yǎng)基菌層為非平面，會影響抑菌圈的形狀。小鋼管放置時，要小心地從同一高度垂直放在菌層培養(yǎng)基上，不得下陷，不得傾斜，不能用懸空往下掉的。放置之后，不能隨意移動，要靜置5min，使之在瓊脂內(nèi)稍下沉降穩(wěn)定后，再開始滴加抗生素溶液。,5. 滴加抗生素溶液滴加抗生素要按照SH→TH→SL→TL的順序滴加。滴加之前，滴管至少要用被滴液體沖

31、洗3次。在滴加抗生素到小鋼管的時候，由于毛細管內(nèi)抗生素溶液往往會有氣泡或者毛細管開口端有液體殘留，繼續(xù)滴加容易造成氣泡膨脹破裂，使溶液濺落在瓊脂培養(yǎng)基表面造成破圈。因此一旦毛細管中出現(xiàn)氣泡或者殘留，就重新吸取抗生素溶液進行滴加，毛細管口應(yīng)避免太細，滴加的時候離開小鋼管口距離不要太高。滴加中若有濺出，可用濾紙片輕輕吸去，不致造成破圈。在滴加中還有可能出現(xiàn)抗生素溶液滴入小鋼管后，沒有與瓊脂培養(yǎng)基菌層接觸，有一段空氣被壓在溶液與培養(yǎng)基之間，這

32、樣是不會產(chǎn)生抑菌圈的。此時可以小心的用滴管吸出小鋼管內(nèi)的抗生素溶液，棄去。換滴管重新滴加?？股厝芤旱渭雍?，液面應(yīng)該與小鋼管管口齊平，液面反光呈黑色。（抗生素液體加入量不能按滴，即使同一滴管，每滴的量也有差異。）如果抗生素溶液滴加過滿，可以用無菌濾紙片小心吸去多余部分。,6. 雙碟中菌株的培養(yǎng)滴加了抗生素溶液后的雙碟忌震動，要輕拿輕放。雙碟在37℃下培養(yǎng)約16h至18h。在培養(yǎng)過程中，如果溫度不均勻，會造成同一雙碟上細菌生長速率不等，使

33、抑菌圈變小或者不圓。所以把雙碟放入培養(yǎng)箱時，要與箱壁保持一定的距離，雙碟疊放也不能超過3個。培養(yǎng)中，箱門不得隨意開啟，以免影響溫度。應(yīng)經(jīng)常注意溫度，防止意外過冷過熱。7. 抑菌圈測量 7.1 試驗結(jié)果中抑菌圈直徑不應(yīng)該過大或者過小，在試驗之前，可以先做一個關(guān)于用不同濃度菌液配制的瓊脂培養(yǎng)基菌層預(yù)試驗，選擇抑菌圈直徑在18～22mm的菌液濃度。,,試驗用濃度（菌液濃度約為106個/mL）。批量試驗中后期，菌液保存的時間過久，菌株就會