大腸桿菌基因工程資料

1、基因工程原理,何光源2016-04-05,第九章 大腸桿菌基因工程,第一節(jié) 大腸桿菌表達體系第二節(jié) 大腸桿菌的表達載體第三節(jié) 克隆的真核基因在大腸桿菌細胞中的表達,2024/1/23,第一節(jié) 大腸桿菌表達體系,2024/1/23,第一節(jié) 大腸桿菌表達體系,大腸桿菌表達體系克隆基因正確表達的基本條件,2024/1/23,大腸桿菌表達體系,基因工程的重要目標之一是，制備按其它方法難以生產(chǎn)的大量純化的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，為此就需

2、要有一種能夠高水平表達異源蛋白質(zhì)或重組蛋白質(zhì)的表達系統(tǒng)。而良好的表達系統(tǒng)的選擇要考慮多方面的因素，如寄主細胞的生長特性、蛋白質(zhì)產(chǎn)物轉(zhuǎn)譯后的修飾與生物活性，以及異源蛋白質(zhì)的表達水平和分泌方式等。目前被選作表達異源蛋白質(zhì)的表達系統(tǒng)有細菌（包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌）、酵母、昆蟲、植物和哺乳動物細胞等。,2024/1/23,大腸桿菌表達體系,比較而言，大腸桿菌表達系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)越性：對大腸桿菌的背景知識，特別是基因表達調(diào)控的分子機理有深刻

3、的了解；一種安全的基因工程實驗體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體；許多克隆的真核基因都可以在大腸桿菌細胞中實現(xiàn)有效、高水平的表達；培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，易于進行工業(yè)化批量生產(chǎn)。,2024/1/23,大腸桿菌表達體系,大腸桿菌中表達體系表達真核基因的不足：真核基因在結(jié)構(gòu)上同原核基因之間存在著很大的差別，在大腸桿菌細胞中不可能具有為真核RNA加工剪輯所需要的酶體系，真核基因很難直接在大腸桿菌細胞中實現(xiàn)功能性表達；

4、真核基因的轉(zhuǎn)錄信號同原核不同。細菌的RNA聚合酶不能識別真核啟動子；外源基因可能含有具有大腸桿菌轉(zhuǎn)錄終止信號功能的核苷酸序列。真核基因mRNA的分子結(jié)構(gòu)同細菌有所差異，影響真核基因mRNA穩(wěn)定性和同細菌核糖體相結(jié)合的能力，從而阻礙正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯；,2024/1/23,大腸桿菌表達體系,許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)過轉(zhuǎn)譯后的加工修飾（正確折疊和組裝），而大多數(shù)的修飾作用在細菌細胞中并不存在；細菌的蛋白酶，能夠識別外來的真核基因所

5、表達的蛋白質(zhì)分子，將其降解。,2024/1/23,大腸桿菌表達體系,為了克服上述這些問題，已經(jīng)發(fā)展出了許多種不同的方法：將克隆的真核基因插入到原核啟動子的下游附近部位，如大腸桿菌Lac操縱子的lac啟動子，Trp操縱子的trp啟動子及tac啟動子，λ噬菌體的PL和PR啟動子以及pBR322載體的β-內(nèi)酰胺酶啟動子從真核細胞中分離完成加工的mRNA，使用反轉(zhuǎn)錄酶合成出cDNA，并連接到適當?shù)妮d體上，可以克服真核基因的間隔子問題；根據(jù)

6、蛋白質(zhì)的氨基酸序列，應(yīng)用化學(xué)方法合成出不帶間隔序列的寡聚脫氧核糖核酸的短片段；通過引進突變的的方法消除細菌中存在的能降解外源真核蛋白質(zhì)的蛋白酶分子。,2024/1/23,克隆基因正確表達的基本條件,最基本條件：能進行正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯，在正常情況下還與翻譯后加工及新生多肽在細胞中的分布有關(guān)。重要條件編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物應(yīng)能維持正常的穩(wěn)定性；具有核糖體結(jié)合位點；具有克隆基因的功能（強）啟動子； 插入序列的正確取向,2024/1/23

7、,第二節(jié) 大腸桿菌的表達載體,2024/1/23,第二節(jié) 大腸桿菌的表達載體,大腸桿菌載體系統(tǒng)大腸桿菌表達載體的基本成分常用的大腸桿菌表達載體,2024/1/23,大腸桿菌載體系統(tǒng),容量：分子較小，可攜帶比較大的DNA片段；復(fù)制：能獨立于染色體而進行自主高效的復(fù)制； 酶切位點：有盡可能多的多種限制酶切位點，但每一種限制酶又要最少的切割位點（多克隆位點 multiple cloning sites，MCS）； 標記：有適合的

8、標記，易于選擇；安全性：要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實驗室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等；表達：有時還要求載體要能啟動外源基因進行轉(zhuǎn)錄及表達，并且盡可能是高效的表達。,2024/1/23,大腸桿菌克隆載體,2024/1/23,大腸桿菌表達載體,2024/1/23,大腸桿菌表達載體的基本成分,組 成 部 分啟動子轉(zhuǎn)錄終止子翻譯起始序列翻譯增強子翻譯終止子,2024/1/23,,啟動子最佳啟動子具備的條件：必須是一種強啟動子

9、，能夠使克隆基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達量占細胞總蛋白的10%~30%以上；應(yīng)能呈現(xiàn)出一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平，具有高度抑制性（抑制型啟動子）；應(yīng)是誘導(dǎo)型的，能通過簡單的方式使用廉價的誘導(dǎo)物得以誘導(dǎo)（誘導(dǎo)型啟動子）。,2024/1/23,,轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子能增強mRNA分子的穩(wěn)定性，從而提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平。啟動子封堵作用：由一個上游啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄作用，當其通過下游啟動子時，會使該啟動子的功能受到抑制，這種由一個啟動子的功能活性抑

10、制另一個啟動子轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象,2024/1/23,,翻譯起始序列 5’-末端結(jié)構(gòu)特征，決定mRNA的轉(zhuǎn)譯起始效率。 在核糖體結(jié)合位點（RBS）的序列結(jié)構(gòu)中，增加腺嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷殘基含量的比例，誘發(fā)堿基發(fā)生定點突變；或使用轉(zhuǎn)譯偶聯(lián)系統(tǒng)進行克隆基因表達,2024/1/23,,翻譯增強子顯著的增加異源基因在大腸桿菌中的表達效率翻譯終止子 mRNA轉(zhuǎn)譯終止必須存在終止密碼子。 大腸桿菌偏愛終止子UAA，尤其是在其

11、后加上U形成UAAU四聯(lián)核苷酸的情況下，轉(zhuǎn)譯終止的效率將進一步的增強。,2024/1/23,常用的大腸桿菌表達載體,Lac啟動子的表達載體Trp啟動子的表達載體PL啟動子的表達載體,2024/1/23,Lac啟動子的表達載體,理論上，凡是具有包括控制區(qū)段在內(nèi)的lac操縱子的質(zhì)粒，都具備了用作克隆基因表達載體的基本條件；突出特點：含有編碼β-半乳糖苷酶的lacZ基因片段；外源DNA片段插入到這個啟動子之后，同時保持著lacZ基因固

12、有的讀碼結(jié)構(gòu)時，重組質(zhì)粒就會合成出一種由外源克隆基因編碼的多肽和β-半乳糖苷酶組成的融合蛋白質(zhì)。,2024/1/23,Trp啟動子的表達載體,優(yōu)點：誘導(dǎo)型，所合成的蛋白質(zhì)產(chǎn)量高于Lac啟動子表達載體系統(tǒng)。生產(chǎn)α-干擾素和γ-干擾素三啟動子串聯(lián)單元表達效率高于單啟動子單元。,2024/1/23,PL啟動子的表達載體,使用最廣泛的大腸桿菌表達載體之一cI基因存在一個溫度敏感突變等位基因。42℃時，阻遏蛋白失活；28~30 ℃時，

13、PL啟動子完全被阻遏蛋白抑制。通過改變溫度來控制PL啟動子的開關(guān),2024/1/23,第三節(jié) 克隆的真核基因在大腸桿菌細胞中的表達,2024/1/23,第三節(jié) 克隆的真核基因在大腸桿菌細胞中的表達,大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對策,2024/1/23,,外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細胞的表達部位細胞質(zhì)中表達周質(zhì)中表達胞外表達,2024/1/23,大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略,包涵體型異源蛋白的表達分泌

14、型異源蛋白的表達融合型異源蛋白的表達寡聚型異源蛋白的表達整合型異源蛋白的表達蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構(gòu)建,2024/1/23,包涵體型異源蛋白的表達,包涵體及其性質(zhì)包涵體（Inclusion Bodies，IB）：特定生長條件下，大腸桿菌能積累特殊生物大分子，在細胞內(nèi)致密集聚，被膜包裹/無膜裸露的水不溶性的結(jié)構(gòu)。富含蛋白質(zhì)，含少量的DNA、RNA和脂多糖氨基酸類似物：多見于含有氨基酸類似物培養(yǎng)基中，由其合成的蛋白質(zhì)喪失

15、其理化特性和生物功能，集聚形成包涵體。由高效表達質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，后者常以包涵體形式存在于細胞內(nèi),2024/1/23,包涵體型異源蛋白的表達,包涵體表達目的蛋白的優(yōu)點：簡化外源基因表達產(chǎn)物的分離操作水難溶性，密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心，即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來一定程度上保持表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶對

16、異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅蛋白質(zhì)沒有活性，不會使寄主細胞受傷害,2024/1/23,包涵體型異源蛋白的表達,蛋白質(zhì)的產(chǎn)量高二硫鍵的斷裂以及轉(zhuǎn)譯修飾作用的喪失，導(dǎo)致外源基因編碼的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中超量表達表達的質(zhì)粒載體構(gòu)建比較簡單,2024/1/23,包涵體型異源蛋白的表達,包涵體表達目的蛋白的缺點：變性復(fù)性操作：以包涵體形式表達的重組蛋白喪失原有生物活性，無正確空間構(gòu)象，必須通過有效的變性復(fù)性操作，回收具有生物活性的目標蛋

17、白。技術(shù)難題--變復(fù)性操作的效率，尤其當目標蛋白中的Cys殘基數(shù)目較高時，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當?shù)?，一般不超過30%N-末端存在甲硫氨酸,影響蛋白質(zhì)的真實性蛋白質(zhì)種類多，純化比較復(fù)雜,2024/1/23,包涵體型異源蛋白的表達,以包涵體形式表達目的蛋白的操作包涵體的形成：若未進行特殊設(shè)計（如分泌型表達或融合型表達），外源基因在大腸桿菌中表達的蛋白量占細胞總蛋白量20%以上時，傾向于形成包涵體基因操作關(guān)鍵--選擇高表達的載體

18、高表達率---包涵體法的優(yōu)勢,2024/1/23,包涵體的變性與復(fù)性操作,蛋白質(zhì)變性復(fù)性的動力學(xué)原理：N 天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)U 變性狀態(tài)的蛋白質(zhì)C 共價修飾的蛋白質(zhì)A 集聚狀態(tài)的蛋白質(zhì)I 有效變復(fù)性過程中的中間狀態(tài)X 脫離有效變復(fù)性過程而進入集聚的中間狀態(tài),細菌內(nèi)，集聚狀態(tài)和共價修飾的蛋白質(zhì)不能進入復(fù)性過程，無活性，包涵體中蛋白質(zhì)屬于這兩種狀態(tài)復(fù)性操作：在體外進行人工變性（解除共價修飾和驅(qū)散集聚體）,2024/1

19、/23,包涵體的變性與復(fù)性操作,包涵體的溶解與變性：拆開錯配的二硫鍵和次級鍵人工條件下，使包涵體溶解、重新進入復(fù)性途徑。試劑和條件：清洗劑 SDS、正十二醇肌氨酸，廉價，但影響復(fù)性和純化促溶劑 鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發(fā)形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應(yīng)混合溶劑 尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強極端pH 廉價，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng),2024/1/2

20、3,包涵體的變性與復(fù)性操作,包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：將多肽鏈中被拆開的游離巰基重新折疊通過次級鍵的形成使蛋白質(zhì)復(fù)性,2024/1/23,包涵體的變性與復(fù)性操作,包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：復(fù)性操作一步稀釋法，蛋白復(fù)性與濃度無關(guān)，但集聚與濃度關(guān)系很大分段稀釋法，逐步降低變性劑的濃度，防止二次集聚試劑添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修飾法，氨基檸檬酸酐?；?，蛋白帶負電，

21、抑制集聚產(chǎn)物隔離法，將變性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞分子伴侶法，GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表達,2024/1/23,包涵體的變性與復(fù)性操作,包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：二硫鍵形成在包涵體變性體系中，始終存在著還原劑，使多肽鏈中的巰基保持還原狀態(tài)，防止二硫鍵錯配導(dǎo)致嚴重的集聚。在變性操作結(jié)束后，這些游離型的巰基必須重新配對形成二硫鍵，此時多肽鏈也重新發(fā)生折疊。形成二硫鍵的方式：化學(xué)氧化法（A

22、）需要電子受體，最廉價的電子受體為空氣，二硫鍵形成是隨機的，僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的重折疊二硫鍵交換（B）需要還原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫鍵形成相對特異，因此適用性較廣，重折疊效果好,2024/1/23,分泌型異源蛋白的表達,大腸桿菌中表達的異源蛋白的定位可溶性或不溶性（包涵體）狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中；通過運輸或分泌方式定位于細胞周質(zhì)；穿過外膜進入培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)分泌的前提條件--N端信號肽序列

23、的存在,2024/1/23,分泌表達形式的優(yōu)點：,目的蛋白穩(wěn)定性高 重組人胰島素原若分泌到細胞周質(zhì)中，其穩(wěn)定性大約是細胞質(zhì)中10倍目的蛋白易于分離目的蛋白末端完整 相當多的真核生物成熟蛋白N端不含甲硫氨酸殘基。這些真核基因在大腸桿菌中表達時，蛋白質(zhì)N端的甲硫氨酸殘基不能被切除。將外源基因與大腸桿菌的信號肽編碼序列重組在一起，實現(xiàn)分泌型表達，其N端的甲硫氨酸殘基便可在信號肽的剪切過程中有效除去,2024/1/23,分泌表達形式的缺

24、點：,大腸桿菌的蛋白分泌機制并不健全：外源真核生物 基因很難在大腸桿菌中進行分泌型表達少數(shù)外源基因能分泌表達，但表達率通常要比包涵體方式低很多產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌并不普遍,2024/1/23,蛋白質(zhì)的分泌機制,原核細菌周質(zhì)中含有多種分子伴侶可阻止分泌蛋白的隨機折疊，分泌在細胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中的重組蛋白很少形成分子間的二硫鍵交聯(lián)；與包涵體相比，分泌型重組蛋白具有較高比例的正確構(gòu)象，生物活性的回收率增加，且對蛋白酶不敏感

25、,2024/1/23,分泌型目的蛋白表達系統(tǒng)的構(gòu)建,絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌不能將蛋白質(zhì)直接分泌到胞外；部分革蘭氏陰性菌能將細菌的抗菌蛋白（細菌素）分泌到培養(yǎng)基中，這一過程嚴格依賴于細菌素釋放蛋白，它激活定位于內(nèi)膜上的磷酸酯酶，導(dǎo)致細菌內(nèi)外膜的通透性增大；將細菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個合適質(zhì)粒上，構(gòu)建完全分泌型受體細胞另一種攜帶大腸桿菌信號肽編碼序列和目的基因的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化完全分泌型受體細胞，使用相同性質(zhì)的啟動子介導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄

26、，實現(xiàn)目的蛋白從重組大腸桿菌中的完全分泌,2024/1/23,,Secretion Cloning Vector,2024/1/23,融合型異源蛋白的表達,異源蛋白的直接表達 融合蛋白：將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，作為一個開放閱讀框架進行表達，這種雜合基因表達出的蛋白質(zhì)為融合蛋白；受體細菌的蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端；回收異源蛋白：雜合基因上引入蛋白酶切位點或化學(xué)試劑特異性斷裂位點，在體外從純化的融合

27、蛋白分子中釋放回收異源蛋白,2024/1/23,融合表達蛋白的優(yōu)缺點,目的蛋白穩(wěn)定性高 尤其對分子量較小的多肽效果更佳目的蛋白易于分離 利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白目的蛋白表達率高 與受體蛋白共用一套完善的表達元件目的蛋白溶解性好 由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和進一步分離，才能獲目的蛋白。

28、在實際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段,2024/1/23,融合型目的蛋白表達系統(tǒng)的構(gòu)建,融合蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建原則：受體細胞的結(jié)構(gòu)基因能高效表達，且其表達產(chǎn)物可以通過親和層析進行特異性簡單純化；外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終止密碼子；盡可能避免融合蛋白兩種組份的分子量過于接近，為目的蛋白分離回收創(chuàng)造條件，并不需要完整的受體結(jié)構(gòu)基因；兩個結(jié)構(gòu)基因拼接位點處的序列設(shè)計十分重要，直接決定著融合蛋白的裂解工

29、藝兩個蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架,2024/1/23,融合型目的蛋白表達系統(tǒng)的構(gòu)建,用于融合蛋白構(gòu)建的受體蛋白：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST） 維持良好空間構(gòu)象硫氧化還原蛋白（TrxA） 維持良好空間構(gòu)象 pTrxFus泛素蛋白（Ubi） 維持良好空間構(gòu)象金黃色葡萄球菌蛋白A（SAPA） 免疫親和層析 pRIT2Tβ-半乳糖苷酶（LacZ） 免疫親和層析外膜蛋白（OmpF） 促進分泌麥芽糖結(jié)合蛋白（M

30、BP） 促進分泌,2024/1/23,目的蛋白的回收,融合蛋白中受體蛋白部分的存在可能會影響目的蛋白的空間構(gòu)象和生物活性，如果將之注入人體還會導(dǎo)致免疫反應(yīng)制備和生產(chǎn)目的蛋白時，需將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去融合蛋白的位點專一性斷裂方法有兩種：化學(xué)斷裂法 酶促裂解法,2024/1/23,目的蛋白的回收,化學(xué)斷裂法：最佳試劑為溴化氰（CNBr），與多肽鏈中的甲硫氨酸殘基側(cè)鏈的硫醚基反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作

31、用下肽鍵斷裂，形成兩個多肽降解片段，其中上游肽段的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基，而下游肽段N端的第一位氨基酸殘基保持不變。優(yōu)點：回收率高 85%以上；專一性強；產(chǎn)生的目的蛋白N端不含甲硫氨酸，接近真核生物細胞中的成熟表達產(chǎn)物如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，則不能用此方法,2024/1/23,目的蛋白的回收,酶促裂解法：單殘基位點特點：斷裂效率更高每種蛋白酶均具有相應(yīng)的斷裂位點決定簇，因此可供選擇的專一性斷裂位點范圍較廣。

32、幾種斷裂位點專一性最強的商品化蛋白酶分別在多肽鏈中的精氨酸、谷氨酸、賴氨酸殘基處切開酰胺鍵，形成不含上述殘基的下游斷裂肽段，與溴化氰化學(xué)斷裂法相似。前提條件：外源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或賴氨酸殘基，適合小分子多肽，大分子量的異源蛋白上述三種氨基酸殘基的出現(xiàn)頻率相當高,2024/1/23,目的蛋白的回收,酶促裂解法：多殘基位點為克服單一氨基酸殘基酶切位點的局限性寡肽序列-多殘基位點：受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子的外

33、源基因之間加裝一段編碼寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接頭片段，為具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的識別和作用序列，斷裂位點在ArgC末端純化后的融合蛋白用Xa處理，可獲得不含上述寡肽序列的目的蛋白Xa的識別作用序列由四個氨基酸殘基組成，大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少，可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不同大小的目的蛋白產(chǎn)物,2024/1/23,寡聚型異源蛋白的表達,從理論上講，外源基因的表達水平與受體細胞中可轉(zhuǎn)錄

34、基因的拷貝數(shù)（即基因劑量）呈正相關(guān)。重組質(zhì)粒含有外源基因外，還攜帶其它的可轉(zhuǎn)錄基因，如作為篩選標記的抗生素抗性基因等。重組質(zhì)?？截悢?shù)的不斷增加，受體細胞內(nèi)的大部分能量和原料被用于合成所有的重組質(zhì)粒編碼蛋白，細胞的正常生長代謝受到影響通過增加質(zhì)?？截悢?shù)提高外源基因表達產(chǎn)物的產(chǎn)量并不能獲得滿意的效果。寡聚串聯(lián)型異源蛋白表達載體的構(gòu)建：將多拷貝外源基因，克隆在低拷貝質(zhì)粒上，通過增加外源基因劑量而提高目標蛋白產(chǎn)量,2024/1/23,以

35、寡聚形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點,目的蛋白高效表達不提高質(zhì)?？截悢?shù)的前提下，增加目的基因的拷貝數(shù)，一定程度上改善表達量穩(wěn)定表達小分子短肽短肽缺乏有效的空間結(jié)構(gòu)，在細菌細胞中的半衰期較短。串聯(lián)短肽具有與蛋白質(zhì)相似的長度及空間結(jié)構(gòu)，因而抗蛋白酶降解的能力大幅度提高目的產(chǎn)物回收困難寡聚短肽需要裂解和進一步分離，才能獲最終分子，但裂解后的短肽分子容易出現(xiàn)序列不均一性,2024/1/23,寡聚型目的蛋白表達系統(tǒng)的構(gòu)建,基本策略：,2024

36、/1/23,整合型異源蛋白的表達,以整合形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點目的基因穩(wěn)定表達整合型的目的基因隨受體細胞染色體DNA的復(fù)制而復(fù)制，在大多數(shù)情況下相當穩(wěn)定，工程菌在沒有選擇壓力存在下可以連續(xù)培養(yǎng)而不丟失目的基因表達盒，改良物種遺傳性狀為目的目的基因表達率低單拷貝整合的目的基因表達率受到限制可通過強化表達元件而加以補償,2024/1/23,DNA體內(nèi)重組的基本原理,在生物體細胞尤其是原核細菌細胞內(nèi)，廣泛存在著DNA的遺傳重組機制

37、，生物學(xué)功效是促進生物種群的進化。細胞內(nèi)的遺傳重組可分為兩大類：轉(zhuǎn)位因子依賴型同源序列依賴型,2024/1/23,DNA體內(nèi)重組的基本原理,轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組：轉(zhuǎn)位因子家族轉(zhuǎn)位因子--生物細胞內(nèi)天然存在的一類無復(fù)制能力的DNA可移動因子，不同生物種群擁有結(jié)構(gòu)不同的轉(zhuǎn)位因子噬菌體G片段（G-Fragment） 原核細菌插入順序（IS） 真核細菌轉(zhuǎn)座子（Tn、Ty） 高等植物可移動因子（Ac、Ds） 高等動物

38、跳躍基因（mobil gene）,2024/1/23,DNA體內(nèi)重組的基本原理,轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組：轉(zhuǎn)位因子的結(jié)構(gòu),2024/1/23,DNA體內(nèi)重組的基本原理,轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組：整合形式,2024/1/23,DNA體內(nèi)重組的基本原理,同源序列依賴型的體內(nèi)重組：基本形式原核細胞中，染色體DNA鏈上的兩個同源區(qū)之間可發(fā)生同源重組，其頻率與細菌種類、兩個同源區(qū)之間的距離、同源區(qū)的長度、同源程度密切相關(guān)。距離越遠、長度越長

39、、同源性越高，重組的頻率也就越高，反之亦然。同源重組有整合和交換兩種形式，前者只需要一個斷裂位點，而后者涉及兩個斷裂位點,2024/1/23,DNA體內(nèi)重組的基本原理,同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源整合,2024/1/23,DNA體內(nèi)重組的基本原理,同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源交換,2024/1/23,蛋白酶抗性 / 缺陷型表達系統(tǒng)的構(gòu)建,穩(wěn)定性：無論在真核生物，還是在原核細胞中，重組目的蛋白都可能被降解，其穩(wěn)定性常常不如半衰期較短

40、的內(nèi)源性蛋白質(zhì)。不穩(wěn)定性根源：對受體細胞蛋白酶系統(tǒng)的敏感性。解決：通過蛋白序列的人工設(shè)計 受體細胞的改造,2024/1/23,蛋白酶缺陷型受體細胞的改造,lon基因缺陷的大腸桿菌受體（lon -）：大多數(shù)不穩(wěn)定的重組目的蛋白被大腸桿菌中的蛋白酶La和Ti降解，分別由lon和clp基因編碼，蛋白水解活性依賴于ATPlon基因由熱休克等環(huán)境壓力激活，細胞內(nèi)異常蛋白或重組異源蛋白的過量表達也可作為一種環(huán)境壓力誘導(dǎo)lon基

41、因的表達。lon -的大腸桿菌突變株可使半衰期較短的細菌調(diào)控蛋白（如SulA、RscA、lN）穩(wěn)定性大增，被廣泛用作外源基因高效表達的受體菌,2024/1/23,蛋白酶缺陷型受體細胞的改造,htpR基因缺陷的大腸桿菌受體（htpR-）：大腸桿菌中龐大的熱休克蛋白家族：降解異?；虍愒吹鞍?，其機理是脅迫異?；虍愒吹鞍仔纬梢环N對蛋白酶識別和降解較有利的空間構(gòu)象，提高異?；虍愒吹鞍讓Φ鞍酌傅拿舾行?。熱休克基因dnaK、dnaJ、groEL

42、、grpE以及環(huán)境壓力特異性s因子編碼基因htpR的突變株均呈現(xiàn)出對異源蛋白降解作用的嚴重缺陷，特別是lon-htpR-的雙缺陷株，非常適合高效表達各種不穩(wěn)定的重組異源蛋白。,2024/1/23,抗蛋白酶的重組異源蛋白序列的設(shè)計,多肽鏈C末端氨基酸序列對穩(wěn)定性的影響極性氨基酸，天門冬氨酸Asp對提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的效應(yīng)最顯著，Asp殘基離C末端越近，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性就越大在多種結(jié)構(gòu)和功能相互獨立的蛋白質(zhì)C末端引入Asp殘基，能顯著地延長

43、蛋白質(zhì)的半衰期,2024/1/23,抗蛋白酶的重組異源蛋白序列的設(shè)計,多肽鏈N末端氨基酸序列對穩(wěn)定性的影響：多肽鏈的N末端序列中含有較高比例的Ala、Asn、Cys、Gln、His，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性顯著改善。N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr的真核生物蛋白質(zhì)，在真核和原核細胞中的半衰期通常很短，尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列（PEST序列），是胞內(nèi)蛋白酶的超敏感區(qū),2024/1/23,基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對策,基

44、因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略,2024/1/23,基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制,工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形式主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，兩種表現(xiàn)形式結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失分配不穩(wěn)定性整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸（curing）,2024/1/23,基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制,工程菌遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機制受體細

45、胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝能量、物質(zhì)的匱乏、外源基因表達產(chǎn)物的毒性，誘導(dǎo)受體細胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)閉合成途徑，啟動降解程序重組質(zhì)粒在受體細胞分裂時的不均勻分配重組質(zhì)粒逃逸的基本原因受體細胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進重組分子的缺失重排,2024/1/23,基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制,重組質(zhì)粒的逃逸率宏觀逃逸率：含有重組質(zhì)粒的工程菌在非選擇性條件下生長時，培養(yǎng)系

46、統(tǒng)中一部分細胞不再攜帶重組質(zhì)粒，這些空載細胞數(shù)與總細胞數(shù)之比。重組質(zhì)粒逃逸的原因：高溫培養(yǎng)、表面活性劑（SDS）、藥物（利福平）、染料（吖啶）促使重組質(zhì)粒滲漏受體細胞中的核酸酶降解重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒在受體細胞分裂時不均勻分配拷貝數(shù)的差異隨著細胞分裂次數(shù)的增多而加劇,2024/1/23,改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略,改進載體受體系統(tǒng)施加選擇壓力控制目的基因的過量表達優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝,2024/1/23,改善基因工程菌

47、不穩(wěn)定性的策略,改進載體受體系統(tǒng)以增大質(zhì)粒穩(wěn)定性為目的構(gòu)建載體--受體系統(tǒng)：將R1質(zhì)粒上的parB基因引入表達型載體中，其表達產(chǎn)物可以選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無質(zhì)粒細胞正確設(shè)置載體上的多克隆位點，禁止DNA片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi)將受體細胞的致死性基因安裝在載體上，同時構(gòu)建條件致死性的相應(yīng)受體系統(tǒng)，如大腸桿菌的ssb基因（DNA單鏈結(jié)合蛋白編碼基因）,2024/1/23,改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略,施加選擇壓力根據(jù)載體上的

48、抗藥性標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素 藥物和食品生產(chǎn)時禁止使用抗生素根據(jù)載體上的營養(yǎng)缺陷型標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營養(yǎng)組份 培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高,2024/1/23,改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略,控制目的基因的過量表達使用可控型啟動子控制目的基因的定時表達及表達程度使用可控型復(fù)制子控制質(zhì)粒的定時增殖或降低質(zhì)粒的拷貝數(shù)優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定培養(yǎng)溫度： 較