鱈魚免疫活性肽的可控制備及其免疫活性研究.pdf

1、免疫活性肽是一類具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能、提高機(jī)體抵御外界病原體感染能力等免疫功能的肽,具有分子量小、穩(wěn)定性強(qiáng),且免疫原性弱、生物活性高等諸多優(yōu)點(diǎn)。目前酶法制備生物活性肽主要集中在活性優(yōu)化和動力學(xué)模擬上,并不能保證酶解按預(yù)期進(jìn)行。而鱈魚免疫活性肽的可控制備及免疫活性研究,是通過采用生物技術(shù)、生物傳感器、數(shù)學(xué)模型、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等實(shí)現(xiàn)了免疫活性肽的準(zhǔn)確預(yù)測、動態(tài)監(jiān)測、可控制備,并且利用樹脂吸附技術(shù)等對免疫活性肽精制,為免疫活

2、性肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。同時(shí)本文還對制備的鱈魚免疫肽的體內(nèi)免疫活性機(jī)理作了初步探討。
　　 本論文形成了以下研究成果:
　　 1、本文以鱈魚加工下腳料鱈魚排為原料作為研究對象,首先研究了其基本組成。鱈魚排中蛋白質(zhì)含量較高(18.4％),以堿溶性蛋白(35.49％)和基質(zhì)蛋白(30.49％)為主,有重要利用價(jià)值。鱈魚排蛋白中以高含量的甘氨酸(26.51％)和谷氨酸(12.57％)為主,其次為丙氨酸、谷氨酰胺

3、、絲氨酸、亮氨酸和賴氨酸。為了充分利用鱈魚蛋白,對鱈魚排進(jìn)行了軟化高壓預(yù)處理研究,條件最終設(shè)定為120℃處理30min。
　　 2、水解度值、分子量分布、多肽含量均是反映酶解產(chǎn)物特征的重要因素,但在線監(jiān)測困難。鱈魚蛋白酶解產(chǎn)物游離氨基酸含量呈現(xiàn)規(guī)律性變化,可作為監(jiān)測水解反應(yīng)的響應(yīng)因子,并且生物傳感器測定響應(yīng)因子速度快、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好。其中對谷氨酸和賴氨酸測定的相對誤差分別為1.5％和1.0％,變異系數(shù)分別為3.85％和3.0

4、3％,標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.78和0.60。多酶切位點(diǎn)下,游離谷氨酸和賴氨酸都呈規(guī)律性變化,與水解度正相關(guān),可作為酶解產(chǎn)物的響應(yīng)因子,同時(shí)在一定水解度范圍內(nèi),游離谷氨酸和賴氨酸濃度與水解度均呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。利用游離谷氨酸和賴氨酸濃度作為響應(yīng)因子監(jiān)測多種商品酶的水解程度是可行的。
　　 3、鱈魚排的胰酶水解產(chǎn)物(PFH)可以顯著促進(jìn)脾細(xì)胞增殖、T細(xì)胞增殖、巨噬細(xì)胞吞噬(p＜0.05)。分子量和水解度是影響脾細(xì)胞增殖活性的重要因素。

5、在水解度15-18％時(shí),PFH的脾細(xì)胞增殖活性最高。采用響應(yīng)面方法確定了鱈魚免疫肽制備參數(shù):蛋白濃度25ge/L、pH值8.0、溫度(50±1)℃、時(shí)間290 min和加酶量24 U/mg,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的平均DH為16.87％,脾淋巴細(xì)胞平均增殖率為28.45％,與理論值相符。PFH在220hm和280nm處有較大吸收峰,氨基酸組成以脯氨酸(15.69％)含量最高。PFH在廣泛的pH范圍具有較好的溶解性,在溫度20-60℃范圍PFH具有較低

6、的粘度;pH對PFH的起泡性、乳化性影響較大。PFH在胃蛋白酶、胰蛋白酶和復(fù)合酶條件下會發(fā)生部分降解,但主要多肽成分的變化很小。
　　 4、在嚴(yán)格控制水解條件下,動力學(xué)模型在一定范圍內(nèi)可以很好的預(yù)測反應(yīng)的進(jìn)行。鱈魚蛋白的胰酶水解的動力學(xué)模型為:R=(0.1693 E0-0.2816 S0)exp|-0.357*DH|,DH=2.801 ln|1+(0.06044 E0/S0-0.1005)t|,胰蛋白酶的失活動力學(xué)常數(shù)為0.05

7、12 min-1。鱈魚免疫肽恒定條件時(shí)的預(yù)測模型:DH=2.801 ln[1+1.35006t],可以通過預(yù)測曲線,獲得免疫肽的制備時(shí)間。這對鱈魚免疫活性肽制備有十分重要的意義。驗(yàn)證試驗(yàn)表明,當(dāng)條件恒定時(shí),實(shí)現(xiàn)了鱈魚免疫肽制備的預(yù)測性,且模型理論值與實(shí)際值相符。但是當(dāng)條件改變時(shí),如攪拌速率的變化、溫度的波動,顯著的影響了最終反應(yīng)產(chǎn)物,模型理論值與實(shí)際值不符。
　　 5、利用生物傳感器,實(shí)現(xiàn)了恒定條件和動態(tài)條件下鱈魚免疫制備的監(jiān)控

8、。恒定條件下,水解度在11-18％時(shí),與游離賴氨酸、谷氨酸呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系,方程式分別為:DH=0.2225[Glu]-5.3097,DH=0.0126[Lys]-1.2275。當(dāng)初始酶濃度或初始底物濃度改變時(shí),谷氨酸、賴氨酸的響應(yīng)濃度與水解度數(shù)學(xué)關(guān)系不明確,呈現(xiàn)無規(guī)律的曲線關(guān)系。盡管不能用統(tǒng)一的數(shù)學(xué)模型確定動態(tài)變化的水解反應(yīng),但是其反應(yīng)臨界值符合很好的的線性關(guān)系,可以用以下公式來表示:[Glu]=0.8186[S0]+0.0346[

9、E0]+0.4506,[Lys]=0.7430[S0]+0.1370[E0]+5.2931。
　　 6、本文利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(BP-ANNs)和生物傳感器,建立了三個(gè)可在動態(tài)變化條件下實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測的網(wǎng)絡(luò)模型分別為:GLU-BP-ANNs的動態(tài)監(jiān)控模型,LYS-BP-ANNs的動態(tài)監(jiān)控模型,GLU-LYS-BP-ANNs的動態(tài)監(jiān)控模型。三個(gè)模型的樣本值與擬合值進(jìn)行比較分析可知,R2值分別為0.9967、0.9964、0.9967,

10、擬合誤差范圍分別為0-4.14％、0-4.56％、0-4.71％,擬合平均相對誤差值分別為1.06％、0.94％、0.99％。利用模型進(jìn)行五次獨(dú)立的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),理論值與實(shí)驗(yàn)值相符合,試驗(yàn)的相對誤差范圍分別為0.23％-2.81％,0.26％-1.91％和0.30％-2.35％。三個(gè)模型在一定程度上實(shí)現(xiàn)了仿真監(jiān)控,均可以用來監(jiān)測水解反應(yīng)的進(jìn)程。三個(gè)網(wǎng)絡(luò)監(jiān)控模型的共性參數(shù)如下:隱含層為1層,輸入層與隱層之間使用logsig傳遞函數(shù),隱層與輸出

11、層之間使用線性purelin函數(shù),網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練函數(shù)采用trainlm,適應(yīng)性學(xué)習(xí)函數(shù)采用learngdm。GLU-BP-ANNs模型確定的其他參數(shù)如下:輸入層節(jié)點(diǎn)分別為初始酶濃度E0、初始底物濃度S0、游離谷氨酸濃度[Glu];輸出層節(jié)點(diǎn)為DH:隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)為10。LYS-BP-ANNs模型確定的其他參數(shù)如下:輸入層節(jié)點(diǎn)分別為初始酶濃度E0、初始底物濃度S0、終產(chǎn)物的賴氨酸濃度[LyS];輸出層節(jié)點(diǎn)為DH:隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)為11。GLU-LYS-B

12、P-ANNs模型確定的其他參數(shù)如下:輸入層節(jié)點(diǎn)分別為初始酶濃度E0、初始底物濃度S0、終產(chǎn)物的[Lys]和[Glu];輸出層節(jié)點(diǎn)為DH;隱層節(jié)點(diǎn)數(shù)為8。
　　 7、利用Sephadex G-25凝膠柱層析、陽離子色譜、反相高效液相色譜對鱈魚免疫肽混合成分反復(fù)純化,獲得了三個(gè)免疫活性肽,并利用反相高效液相色譜C18分析柱純度鑒定,得到單一對稱的單峰。利用Nano-ESI-Ms/Ms分別對三個(gè)活性肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。免疫肽Y3的分子量為

13、583.9922Da,為五肽,肽序列為Asn-Gly-Met-Thr-Tyr,在20μg/mL時(shí)的脾細(xì)胞平均增殖率分別為35.92％。免疫肽H2的分子量為470.1422Da,其肽序列為Asn-Gly-Leu-Ala-Pro,為五肽,在濃度20μg/mL時(shí),脾淋巴細(xì)胞增值率平均值為32.96％。免疫活性肽S4的分子量為305.1622Da,為二肽,其序列為Trp-Thr,在濃度20μg/mL時(shí),脾淋巴細(xì)胞增值率平均值為31.35％。

14、r>　　 8、本文進(jìn)一步研究了PFH對正常小鼠、免疫低下小鼠的免疫機(jī)理。PFH能顯著提高正常小鼠的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性(p＜0.05)、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(p＜0.05)和單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力(p＜0.05),而對免疫器官指數(shù)和血清溶血素的影響較小(p＞0.05)。對于免疫功能低下小鼠,PFH能顯著提高小鼠的免疫器官指數(shù)(P＜0.05);顯著促進(jìn)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(p＜0.05),提高小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力(P＜0.05),提高小鼠的細(xì)

15、胞免疫功能:提高血清溶血素含量(P＜0.05),促進(jìn)小鼠的體液免疫功能;顯著促進(jìn)小鼠的碳廓清能力(P＜0.01)和腹腔巨噬細(xì)胞對雞紅細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)(P＜0.05,P＜0.01),促進(jìn)小鼠的非特異性免疫功能。
　　 9、在免疫肽的精制中,DA201-C樹脂對PFH的吸附能力最強(qiáng),靜態(tài)吸附最佳條件為:溫度25℃,pH4.0,多肽濃度10 mg/mL,樹脂質(zhì)量與多肽體積比(g/mL)2:1,吸附時(shí)間3 h,吸附率可達(dá)84.7％