三種檢測ampc酶方法的比較

1、<p>　　三種檢測AmpC酶方法的比較</p><p>　　作者：陳林珍，李曉穗，劉一鳴，鄒燕 </p><p>　　【關鍵詞】 表型篩選法 </p><p>　　摘要:目的 采用三維試驗、表型篩選法及頭孢西丁紙片藥敏法(K-B法)同時檢測腸道G-桿菌的AmpC酶，并加以比較，找出一種適合臨床常規(guī)應用的檢測AmpC酶的方法。方法 用頭孢硝噻吩法檢測出9

2、7株β內(nèi)酰胺酶陽性的腸道G-桿菌作為試驗待測菌，用頭孢西丁藥敏法、表型篩選法測定細菌耐藥情況，以判斷產(chǎn)AmpC酶的情況。用三維分析法測定細菌粗提物中的AmpC酶情況。 結(jié)果 97株腸道桿菌頭孢西丁藥敏法結(jié)果顯示產(chǎn)AmpC酶共有36 株，占37.1%（36 /97），與三維試驗比較總符合率為74.2%。表型篩選法產(chǎn)AmpC酶的菌株有15株，占15.5%（15/97），與三維試驗比較總符合率為91.8 %。結(jié)論 表型篩選法與三維試驗法比較差

3、異無顯著性。表型篩選法可以作為一種臨床快速、簡便、可靠的檢測AmpC酶的方法。 </p><p>　　關鍵詞:頭孢西丁藥敏法；三維試驗；表型篩選法；AmpC酶 </p><p>　　Abstract: Objective using three dimensional taest,phenotype screening taest and Cefoxitin sensitive test

4、to detect AmpC enzyme of intestinal G- Bacillus,then compare and set up a new convenient routine method in clinical laboratoies. Methods Using nitrocefin test 97 βlactams nezymes(+)intestinal Bacillus as test.Cefoxitin

5、sensitive test and phenotype screening were performened to detect the resistance in 97 intestinal Bacillus.The three dismensional tests was performened to detect the AmpC enzy</p><p>　　Key words:cefoxitin se

6、nsitive test; three dismensional tests; phenotype screening; AmpC enzymes </p><p>　　AmpC β內(nèi)酰胺酶(簡稱AmpC酶)是由腸桿菌科細菌或/和綠膿假單胞菌的染色體或質(zhì)粒介導產(chǎn)生的一類作用于頭孢菌素、且不被克拉維酸所抑制的β內(nèi)酰胺酶，故AmpC酶又稱作為頭孢菌素酶［1,2］。隨著β內(nèi)酰胺類抗生素、尤其是頭孢菌素的廣泛應用，產(chǎn)Am

7、pC酶的G-桿菌越來越多見，已逐漸引起臨床醫(yī)師的關注［3］。我科用頭孢西丁藥敏法、表型篩選法、三維試驗檢測97株腸道G-桿菌，加以比較，以找出一種合適臨床常規(guī)應用檢測AmpC酶的方法。 </p><p><b>　　1 材料與方法 </b></p><p><b>　　1.1 菌株 </b></p><p>　　從臨床

8、病人痰、血、尿、分泌物中分離的97株腸道G-桿菌株，質(zhì)控菌株陰溝腸桿菌O29M和1194E從衛(wèi)生部臨檢中心購得，分別作為AmpC酶陽性和陰性對照，大腸埃希菌ATCC25922為三維試驗指示菌。 </p><p>　　1.2 儀器與試劑 </p><p>　　M-H瓊脂、肉湯由杭州天和微生物試劑公司購得，低溫冰凍離心機為德國Hettich公司生產(chǎn)， 型號：Zentrifugen D―785

9、32 Tuttlingen,恒溫箱，藥敏紙片為OXOID公司產(chǎn)品。 </p><p>　　1.3 頭孢西?。‵OX）藥敏法［4］ </p><p>　　按NCCLS標準1999版操作，待測菌株對FOX耐藥，視為初篩AmpC酶陽性。 </p><p>　　1.4 表型篩選法［3］ </p><p>　　按NCCLS標準1999版操作，用亞胺

10、培南（IPM）、頭孢吡肟（FEP）、頭孢他啶/克拉維酸（CD02）、頭孢噻肟/克拉維酸（CD03）、頭孢噻肟（CTX）5種紙片進行篩選。判斷標準：FEP、IPM表現(xiàn)為敏感，而CD02、CD03、CTX表現(xiàn)為耐藥或在CD02、CD03和CTX的抑菌環(huán)內(nèi)存在散在菌落判斷為AmpC酶陽性；IPM表現(xiàn)為敏感，而FEP、CTX、CD02、CD03均耐藥，提示待測菌株產(chǎn)AmpC酶的同時也產(chǎn)生其他β內(nèi)酰胺酶，如產(chǎn)ESBLs。 </p>

11、<p>　　1.5 三維試驗法 </p><p>　　1.5.1 酶粗提物的制備［5］ </p><p>　　待測菌于肉湯中增菌，接種于M-H平板(直徑為9 cm)中，置于37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育24 h。刮取1/4平板的密布菌落于1 mL生理鹽水中混勻。-20 ℃反復凍溶5次,每次凍的時間不少于2 h。12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清液，經(jīng)M-H平板上

12、常規(guī)細菌培養(yǎng)陰性后于-20 ℃保存。 </p><p>　　1.5.2 三維試驗［6］ </p><p>　　將大腸埃希菌ATCC25922制成0.5麥氏單位的菌懸液，用棉棒均勻涂布于M-H平板上，稍干后，在平板中央貼30 μg的FOX紙片，在距離紙片5 mm處向外緣方向打一長10 mm，寬1 mm的矢狀槽，在槽內(nèi)加30 μL粗酶提取物。置于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h。觀察槽

13、內(nèi)側(cè)端(FOX紙片的抑菌環(huán)內(nèi))周圍有無細菌生長，如槽附近的抑菌圈縮小或變形均提示細菌產(chǎn)AmpC酶，即為三維試驗陽性，如抑菌圈無絲毫變化則為三維試驗陰性。 </p><p>　　1.6 統(tǒng)計學處理 </p><p>　　采用χ2檢驗，以P&lt;0.05為差異有顯著性。 </p><p><b>　　2 結(jié) 果 </b></p&

14、gt;<p>　　2.1 97株腸道G-桿菌都經(jīng)頭孢硝噻吩法檢測為β內(nèi)酰胺酶陽性，其中三維試驗AmpC酶陽性率為155%(15/97)。 </p><p>　　2.2 頭孢西丁藥敏法、表型篩選法與三維試驗結(jié)果符合率比較 見表1。97株腸道桿菌頭孢西丁藥敏法結(jié)果顯示產(chǎn)AmpC酶共有36 株，占37.1%（36 /97），與三維試驗相比總符合率為74.2%，經(jīng)卡方檢驗，差異有顯著性(P&l

15、t;0.05)。表型篩選法產(chǎn)AmpC酶的菌株有15株，占15.5%（15/97），與三維試驗相比總符合率為91.8 %，差異無顯著性（P&gt;0.05）。表1 三種AmpC酶檢測法結(jié)果比較（略） </p><p><b>　　3 討 論 </b></p><p>　　1989年Bauernfeid 在漢城首次發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導的AmpC酶。近年來世界各地陸續(xù)

16、報道了各種型別的由染色體和持粒介導的AmpC酶。AmpC酶按其產(chǎn)生的方式分為3類：誘導高產(chǎn)酶、持續(xù)高產(chǎn)酶和持續(xù)低產(chǎn)酶。其中持續(xù)高產(chǎn)酶是指菌株因為去阻遏突變，引起AmpC酶的大量表達，質(zhì)粒介導的AmpC酶往往都屬于此類AmpC酶［6］。目前認為很多G-桿菌如腸桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬、銅綠假單胞菌等絕大多數(shù)均可產(chǎn)生低水平染色體介導的誘導型AmpC酶，因而對染色體介導的誘導型AmpC酶的檢測無多大的臨床意義［7］。質(zhì)粒介導的持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶

17、可見于克雷伯菌、沙門菌、大腸埃希菌等，產(chǎn)生這種AmpC酶的細菌具有較強的橫向傳播能力［8］，此種質(zhì)粒同時偏碼對其他抗生素的耐藥性，表現(xiàn)為對第一代到第三代頭孢菌素、頭霉素、氨基糖苷類及抗假單孢菌青霉素均耐用藥，但對碳青霉烯類、第四代頭孢菌素和氟喹諾酮類敏感，故對此類質(zhì)粒介導的持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶的檢測，對于及早發(fā)現(xiàn)并控制耐藥性的傳播具有重要的意義［9］，是臨床微生物實驗室檢測的重點。但目前尚未有一種簡便、可靠的適用于臨床微生物試驗室常規(guī)使

18、用的檢測方法。酶提取物三維試驗雖</p><p>　　頭孢西丁藥敏法操作簡便，但因不產(chǎn)AmpC酶的G-桿菌對頭孢西丁也有一定的耐藥率［6］，與三維試驗法的總符合率僅為74.2 %（72/97），故此法僅可作為初步篩選方法；表型篩選法操作簡便，快速省時，結(jié)果基本可靠，跟三維試驗法有較高的符合率為 91.8 %（89 /97），與趙虎［6］等報道的符合率(89.58%)相近，且與三維法比較差異無顯著性，可以作為臨床常

19、規(guī)快速檢測的方法加以推廣應用。 </p><p><b>　　參考文獻: </b></p><p>　?。?］BUSH K,JACOBY G A,Medeiros A A. A functional classification for βlactoamases and it correlation with molecular structure［J］. Antim

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22、. </p><p>　　［7］陳民均.細菌對β內(nèi)酰胺藥的耐藥性及檢測方法［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2001,24:197. </p><p>　?。?］BRADFORD P A,URBAN C.Imipenem reistance in klebsiella pmeumomiae is associated with the combination of ACT-1,a plasmid