三種檢測(cè)方法對(duì)乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物的比較研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 全球有超3.5億人口感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV),而中國(guó)是一個(gè)HBV感染的大國(guó),感染率約7.18％。肝細(xì)胞癌(HCC)在癌癥死亡率中已躍升為第四位,男性患者是第三位,而HBV就是其主要病因。目前HBV血清學(xué)標(biāo)志物(Hepatitis B Virus Serological markers,HBV-M)的檢測(cè)普遍采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immuno

2、sorbent assay,ELISA)方法。近來(lái)出現(xiàn)了時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)(Time resolved fluorescence immunoassay,TRFIA)與化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)(Chemiluminescence Immunoassay,CLIA)檢測(cè)HBV-M(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb)；在HBV-M檢測(cè)領(lǐng)域還有免疫膠體金技術(shù)(Colloidal goldimmunoassay,CGIA

3、),放射免疫技術(shù)(Radioimmunoassay,RIA),等等。ELISA其優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì),成批檢測(cè)時(shí)間不長(zhǎng),儀器設(shè)備要求不高,但準(zhǔn)確性較差,且不能定量；TRFIA方法其優(yōu)點(diǎn)是可定量,靈敏度與特異性較ELISA優(yōu)越,但其檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng),標(biāo)本消耗量大；CLIA方法其優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)時(shí)間短,靈敏度與特異性高,但需配套的儀器設(shè)備與試劑,檢測(cè)成本高；CGIV方法其優(yōu)點(diǎn)是快速、不需儀器設(shè)備、單份測(cè)試成本低,但其靈敏度較低,難以進(jìn)行質(zhì)量控制；RIA方法其優(yōu)

4、點(diǎn)是靈敏度高,經(jīng)濟(jì),但存在放射性污染。方法較多,不同的檢測(cè)方法得出的結(jié)果有所差異,其差異隨著人們對(duì)自身健康的關(guān)注而引起的醫(yī)療糾紛表現(xiàn)越來(lái)越突出。如乙肝病毒表面抗原(HBsAg)假陰性產(chǎn)生的輸血安全問(wèn)題,還有的問(wèn)題如人們還沒(méi)有意識(shí)到已感染HBV與肝炎,而未采取干預(yù)措施,如減少飲酒注意休息等一般措施和采取抗病毒治療等特殊措施等從而發(fā)展為肝硬化肝癌等。如表面抗原為假陽(yáng)性產(chǎn)生的最大問(wèn)題是會(huì)使受檢者加重心理負(fù)擔(dān),影響到婚姻、就業(yè)、家庭等。

5、　　 HBV的防治方案的合理選擇,有賴(lài)于HBV血清標(biāo)志物檢測(cè)的準(zhǔn)確。我國(guó)目前檢測(cè)HBV-M主要有ELISA、TRFIA、電化學(xué)發(fā)光免疫分析(Electricalchemiluminescence Immunoassay,ECLIA)三種方法,因此,我們對(duì)三種方法的靈敏度、特異度、假陽(yáng)性率、假陰性率、檢測(cè)時(shí)間、標(biāo)本消耗量等的比較來(lái)闡述三檢測(cè)方法對(duì)HBV各血清標(biāo)志物檢測(cè)差異的程度及因?yàn)?從而分析各檢測(cè)方法的優(yōu)劣與應(yīng)用價(jià)值；并基于我國(guó)目前實(shí)

6、際情況探討ELISA方法檢測(cè)HBsAb的S/CO比值應(yīng)用于免疫保護(hù)范圍,以及ELISA測(cè)定低濃度nasAg的函數(shù)判斷結(jié)果的準(zhǔn)確性?？傊?只有HBV-M結(jié)果準(zhǔn)確,才有更科學(xué)個(gè)性化的防治方案,使易感者得到有效保護(hù),乙肝感染者能延緩肝硬化肝腫瘤的病程進(jìn)展、甚至治愈。
　　 方法：
　　 1.ECLIA、TRFIA、ELISA三種方法測(cè)定HBV血清標(biāo)志物差異性比較
　　 452例標(biāo)本來(lái)自2009年10月～2009年12月

7、來(lái)我院就診人員,其中男267例,女185例,年齡O歲～86歲,均齡41.2歲。第一部分來(lái)自分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(90例,均為肝炎患者,且已知FQ-HBV-DNA定量的結(jié)果),采取三種方法平行檢測(cè)HBV-M。第二部分來(lái)自免疫定量實(shí)驗(yàn)室(182例),檢測(cè)順序?yàn)镋CLIA、ELISA、TRFIA。第三部分來(lái)自免疫定性實(shí)驗(yàn)室(180例),檢測(cè)順序?yàn)镋LISA、ECLIA與TRFIA平行檢測(cè)。操作及結(jié)果判斷嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。ELISA以S/CO比值

8、表示其量化程度,ECLIA的HBsAb為定量數(shù)據(jù),其單位為mIU/ml；HBsAg、HBeAg、HBeAb、HBcAb四項(xiàng)則以COI(Cutoff index)指數(shù)來(lái)衡量量化程度,TRFIA測(cè)定結(jié)果均為定量結(jié)果,HBsAg的單位是ng/ml,HBsAb的單位是mIU/ml,HBeAg、HBeAb、HBcAb三項(xiàng)的單位是PEI U/ml。TRFIA、ELISA采用衛(wèi)生部臨檢中心的質(zhì)控品加強(qiáng)質(zhì)量控制,而ECLIA以廠家的原裝配套質(zhì)控品加強(qiáng)質(zhì)

9、量控制。對(duì)三種方法檢測(cè)HBsAg結(jié)果不一致的17例標(biāo)本再采用表面抗原確認(rèn)試劑以及采用HBV熒光PCR定量(FQ-HBV-DNA)再行確認(rèn)。接著對(duì)ECLIA陰性、TRFIA陽(yáng)性、FQ-HBV-DNA陽(yáng)性的5例標(biāo)本再采用Roche與Abbott兩公司的ECLIA方法復(fù)查以確認(rèn)是否為標(biāo)本受到污染抑或?yàn)镋CLIA檢測(cè)突變能力以外的新突變體。
　　 2.ELISA方法S/CO比值應(yīng)用于乙肝病毒表面抗體保護(hù)范圍初探
　　 756例標(biāo)

10、本來(lái)自2008年8月～2009年10月我院查體人員,男480例,女276例,年齡0歲～86歲,均齡41.04歲。每份標(biāo)本均用ELISA測(cè)定HBsAb,ECLIA測(cè)定HBsAb與HBsAg。操作及結(jié)果判斷嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；前者以S/CO比值表示其量化程度,≥1判為陽(yáng)性,后者可直接定量,≥10IU/L判定為陽(yáng)性。ELISA以10IU/L、30IU/L的HBsAb質(zhì)控品加強(qiáng)質(zhì)量控制,ECLIA以配套質(zhì)控品加強(qiáng)質(zhì)量控制。并以ECLIA為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)

11、評(píng)價(jià)ELISA測(cè)定HBsAb的特異性、靈敏度及其相關(guān)性。
　　 3.ELISA測(cè)定低濃度乙肝病毒表面抗原結(jié)果準(zhǔn)確性函數(shù)判斷
　　 收集2009年10月～2009年12月ELISA檢測(cè)HBsAg的S/CO比值位于0.5～5.0之間的170份標(biāo)本,23份組合模式奇特且HBsAg的S/CO比值≤11.0的標(biāo)本(男125例,女68例,年齡0～81歲,均齡41.4歲,其中10例為新生兒)。COBASe601平臺(tái)檢測(cè)HBsAg后,置

12、-20℃低溫冰箱保存。標(biāo)本收集完畢后從ECLIA復(fù)查HBsAg陽(yáng)性中隨機(jī)抽取40例作表面抗原中和確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。分析ELISA測(cè)定HBV-M的組合模式；并以HBsAg為因變量,ELISA測(cè)定的HBV-M五項(xiàng)以及年齡、性別為自變量進(jìn)行多因素Logiest回歸,得出回歸方程。根據(jù)回歸方程計(jì)算的P值從而初步判斷ELISA方法測(cè)定HBsAg的結(jié)果是否準(zhǔn)確。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 采用Excel電子表格軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)登記,SPSS1

13、6.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。ELISA、TRFIA、ECLIA檢測(cè)HBV-M的陽(yáng)性率其差異采用Pearson卡方檢驗(yàn),兩兩比較則采用partitions of x2 method,一致性檢驗(yàn)檢驗(yàn)采用Kappa檢驗(yàn)。
　　 ELISA和ECLIA測(cè)定同一份標(biāo)本的HBsAb結(jié)果配對(duì),其差異采用McNemar卡方檢驗(yàn),一致性檢驗(yàn)檢驗(yàn)采用Kappa檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用直線回歸。
　　 ELISA和ECLIA測(cè)定同一份標(biāo)本的HBs

14、Ag結(jié)果配對(duì),其差異采用McNemar卡方檢驗(yàn),一致性檢驗(yàn)檢驗(yàn)采用Kappa檢驗(yàn)；再以ECLIA測(cè)的HBsAg為因變量、ELISA測(cè)定的HBV-M為自變量進(jìn)行Logiest回歸。
　　 檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1.ELISA與TRFIA檢測(cè)HBsAg具有一定的假陽(yáng)性和假陰性,但三種檢測(cè)方法檢測(cè)的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；三種方法檢測(cè)HBsAb與HBeAg的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

15、P>0.05);而HBeAb、HBcAb的陽(yáng)性率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 2.與ECLIA相比,ELISA測(cè)定的HBsAb具有肯定的免疫保護(hù)作用的S/CO比值為大于13.0；不具有免疫保護(hù)作用的S/CO比值為<5.0。
　　 3.在沒(méi)有ECLIA復(fù)查ELISA測(cè)定低濃度HBsAg的情況下,可利用函數(shù)求出的P值推斷結(jié)果的準(zhǔn)確性,以P=0.5為臨界點(diǎn),P值越大,陽(yáng)性預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度越高,P值越小,陰性預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度越高。<