家蠶核型多角體病毒Bm41和Bm51基因分析.pdf

1、到目前為止，有48種昆蟲桿狀病毒的基因組被完全測(cè)序，而家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinucloepolyhedrivirus，BmNPV)作為桿狀病毒的模式病毒之一，得到了越來(lái)越廣泛的研究和應(yīng)用.目前，有許多基因的功能已了解清楚，例如Bm67、Bm56、Bm9等，但仍有許多基因的功能尚是未知。本研究中，選取了orf41和orf51兩個(gè)功能未知基因?yàn)檠芯繉?duì)象，從基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)、亞細(xì)胞定位、病毒結(jié)構(gòu)定位、基因缺失等方面研究基因的

2、基本特性及其初步功能，從而豐富桿狀病毒分子生物學(xué)理論，并為下一步深入分析基因功能和相關(guān)病毒基因工程研究提供基礎(chǔ)。 本研究的主要結(jié)論如下： 1.BmNPVorf41(Bm41)基因分析Bm41位于BmNPV(T3株)基因組39204-39788nt，讀碼框全長(zhǎng)585bp，編碼194個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量約為23.3kDa.在Bm41起始密碼子ATG上游146nt處有一桿狀病毒晚期轉(zhuǎn)錄基序CAGT。用BLASTP工具搜索Gen

3、Bank和SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，在25種目前已經(jīng)測(cè)序的鱗翅目基因組中存在Bm41的同源序列，包括GroupINPV和GroupIINPV，但在于鱗翅目GVs和其它桿狀病毒并未發(fā)現(xiàn)。因而推測(cè)，Bm41及它的同源基因是鱗翅目昆蟲核型多角體病毒特有基因，在其它桿狀病毒寄主系統(tǒng)中，這個(gè)基因可能是非必需的或細(xì)胞內(nèi)因子可以補(bǔ)償這種缺陷。 為了進(jìn)一步研究Bm41在病毒侵染循環(huán)中的作用，利用ET重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了Bm41的突變病毒，進(jìn)

4、而利用Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建了一個(gè)在多角體位點(diǎn)重新補(bǔ)回Bm41的補(bǔ)回病毒，電鏡分析表明，敲除Bm41影響了病毒核衣殼的形成以至進(jìn)一步影響了成熟的ODV形成多角體。Westernblot分析表明，Bm41既不是ODV也不是BV的結(jié)構(gòu)蛋白的組成部分。細(xì)胞內(nèi)定位表明，Bm41可能在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均有功能。轉(zhuǎn)錄和表達(dá)時(shí)相表明Bm41是一個(gè)早期轉(zhuǎn)錄的基因。用突變的病毒感染細(xì)胞樣品進(jìn)行westernblot分析表明，一些晚期基因的表達(dá)受到了影

5、響，ODV-EC27的表達(dá)受到了明顯的下調(diào)，多角體基因的表達(dá)則受到了抑制，不再表達(dá)。 生物測(cè)定分析表明，與突變前野生病毒相比，突變的Bm41病毒延長(zhǎng)了宿主昆蟲的LT50，也提高了宿主昆蟲的LD50。BV滴度分析表明，Bm41的突變大大降低了BV在細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)量。 綜上所述，BmNPVorf41是一個(gè)早期基因，編碼的蛋白與結(jié)構(gòu)蛋白無(wú)關(guān)。Bm41的突變影響了病毒DNA復(fù)制并在細(xì)胞和蟲體內(nèi)產(chǎn)生了很低產(chǎn)量的BV。而且，Bm41缺少

6、的病毒對(duì)宿主昆蟲的感染力降低并延長(zhǎng)了對(duì)宿主昆蟲的致死時(shí)間。電鏡分析表明，Bm41的突變影響了核衣殼的形成。因此推測(cè)，Bm41盡管不是病毒復(fù)制的必需基因，但是在BV和ODV形成方面均起著重要作用，且是影響病毒在體內(nèi)和體外感染力的重要基因。 2.BnNPVorf51(Bm51)基因分析Bm51位于BmNPV(T3株)基因組45935-46402nt，讀碼框全長(zhǎng)468bp，編碼一個(gè)長(zhǎng)155個(gè)氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測(cè)分子量為18.5kDa

7、。在Bm51起始密碼子ATG上游26nt處有1個(gè)桿狀病毒晚期轉(zhuǎn)錄基序CAGT。RT-PCR分析表明，Bm51在4.5hp.i.開始轉(zhuǎn)錄。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了GST-Bm51融合蛋白并利用該蛋白制備了多克隆抗血清。利用此抗血清進(jìn)行Bm51的表達(dá)時(shí)相分析發(fā)現(xiàn)，Bm51的表達(dá)產(chǎn)物在6hp.i.被檢測(cè)出來(lái)。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，Bm51是一個(gè)桿狀病毒早期表達(dá)基因。 利用抗Bm51的特異性抗體，對(duì)提取純化的BV和ODV進(jìn)行了wester

8、nblot分析，在提純的BV泳道中出現(xiàn)了的23kDa陽(yáng)性條帶。在ODV中沒有檢測(cè)出陽(yáng)性條帶。因此Bm51蛋白是BV特異性的結(jié)構(gòu)蛋白。為了精確確定Bm51在BV中的定位。進(jìn)一步將BV分離為BV核衣殼蛋白(BV-NC)和BV囊膜蛋白(BV-E)。利用Bm51抗體去雜交BV-NC和BV-E，發(fā)現(xiàn)只能在BV囊膜蛋白(BV-E)上雜交到陽(yáng)性條帶，而在BV-NC并沒有任何條帶。說(shuō)明Bm51基因編碼了與BV核衣殼相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白。 為了對(duì)Bm5