中國美利奴綿羊453O11 BAC克隆片段序列組成與結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、本研究以中國美利奴綿羊453O11 BAC克隆片段序列為研究對(duì)象，采用噬菌斑原位雜交的方法從cDNA文庫中篩選表達(dá)序列，對(duì)中國美利奴綿羊453O11 BAC克隆片段序列的組成與結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,為以后探索綿羊MHC class I區(qū)段的基因與綿羊疾病相關(guān)性，篩選優(yōu)良的綿羊品種，研制有效的疫苗提供理論依據(jù)。
　　 采用基因預(yù)測(cè)與PCR相結(jié)合的方法，從綿羊cDNA文庫中獲得表達(dá)基因。通過使用真核生物軟件Genscan 1.0（http:

2、//CCR-081.mit.edu/GENESCAN.html）和Fgenesh軟件對(duì)453O11 BAC克隆片段序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，獲得了15個(gè)基因的CDs序列和蛋白質(zhì)序列。將預(yù)測(cè)得到的蛋白質(zhì)序列與GeneBank上的Nr庫進(jìn)行Blastp比對(duì)，從而得到各個(gè)基因的蛋白序列相關(guān)的基因注釋。以獲得的CDs區(qū)序列為模板設(shè)計(jì)了四對(duì)引物Cxxy10、Cxxy11、Cxxy13和Cxxy15，采用PCR的方法從cDNA文庫中擴(kuò)增表達(dá)基因。四對(duì)引物中

3、，有Cxxy10、Cxxy13和Cxxy15三對(duì)引物成功的從綿羊cDNA文庫中擴(kuò)增得到了表達(dá)基因。將擴(kuò)增序列測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與453O11克隆片段進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，C10基因與453O11克隆序列相似性達(dá)到了94.7％，C13基因的相似性為97.3％，C15基因的相似性達(dá)到了99.2％。這就說明在該克隆上的確存在這三個(gè)基因。由此可知，采用基因預(yù)測(cè)與PCR相結(jié)合的方法，可以快速高效的從cDNA 文庫中獲得表達(dá)基因。
　　 通過基因

4、預(yù)測(cè)與PCR相結(jié)合的方法獲得的表達(dá)序列片段過短，不利于基因功能的研究。所以，為了獲得基因的全序列，本研究采用了噬菌斑原位雜交的方法從cDNA文庫中篩選出相應(yīng)基因的原克隆。以三個(gè)基因的PCR產(chǎn)物制備探針，進(jìn)行噬菌斑原位雜交，3個(gè)基因都篩選到了陽性克隆。將篩選的陽性克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用MegAlign軟件與453O11克隆進(jìn)行比對(duì)。比對(duì)結(jié)果顯示，C10基因含有2個(gè)外顯子，C13和C15基因分別含有3個(gè)外顯子。將8個(gè)外顯子在453O11克隆

5、序列上進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)C13基因和C15基因存在外顯子選擇性剪接。因此，通過噬菌斑原位雜交的方法可以獲得表達(dá)基因的全序列，這為后續(xù)進(jìn)行基因功能的研究提供了基礎(chǔ)。
　　 將測(cè)序結(jié)果與GeneBank上的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示C10基因和C13都與牛的朊蛋白基因和類朊蛋白基因以及牛的ABCG2基因、PKD2基因和SPP1基因具有很高的相似性，這就表明C10基因和C13基因可能與某些綿羊疾病的易感性相關(guān)。C15基因與牛的

6、反轉(zhuǎn)錄酶基因有很高的相似性，表明C15基因可能與一些與反轉(zhuǎn)錄相關(guān)的疾病有關(guān)。因此，對(duì)這三個(gè)基因功能的研究將有助于對(duì)家畜致病機(jī)理的進(jìn)一步了解，對(duì)家畜疾病防御有重要意義。
　　 將三個(gè)基因與GeneBank上的SNPs數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)C10基因存在多態(tài)性。設(shè)計(jì)引物，對(duì)11種綿羊品種的基因組DNA進(jìn)行C10基因的體外擴(kuò)增，將擴(kuò)增序列測(cè)序，進(jìn)行多重比對(duì)。比對(duì)結(jié)果顯示，C10基因在該片段序列上存在著豐富的多態(tài)性。這豐富的多態(tài)性，為后面