豬鏈球菌與宿主細(xì)胞的相互作用以及毒力相關(guān)蛋白HP0197的功能研究.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis，S.suis)是一種重要的細(xì)菌性豬病病原，其常給全球的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。當(dāng)感染S.suis后，病豬通常會(huì)出現(xiàn)腦膜炎，關(guān)節(jié)炎，心內(nèi)膜炎，以及敗血癥等癥狀。該菌按照血清型的不同，可分為33個(gè)血清型(1型-31型，33型和1/2型)，其中豬鏈球菌血清型2型(Streptococcus suis serotype2，SS2)在世界范圍內(nèi)被廣泛報(bào)道為最主要的致病性血清型。另外，S.suis也是一種

2、重要的人畜共患病病原。從丹麥的第一例人感染豬鏈球菌病例開(kāi)始，S.suis已經(jīng)在全球至少20個(gè)國(guó)家造成超過(guò)700人感染。盡管豬鏈球菌已在全球引起了高度的關(guān)注，然而當(dāng)前對(duì)其致病機(jī)理的研究還很有限。病原菌粘附到宿主細(xì)胞或組織表面以及其隨后的侵入與擴(kuò)散過(guò)程是病原菌致病的關(guān)鍵步驟。并且病原菌與宿主之間的相互作用參與著所有這些過(guò)程。因此，研究病原菌的致病機(jī)理也就是研究病原菌與宿主的相互作用過(guò)程。本研究試圖以一些S.suis的表面毒力相關(guān)蛋白為誘餌，

3、通過(guò)鑒定該蛋白與宿主細(xì)胞之間的相互作用，為解釋其生物學(xué)功能與致病機(jī)理提供理論依據(jù)；另一方面，能夠與宿主細(xì)胞發(fā)生相互作用的細(xì)菌表面蛋白大多參與著細(xì)菌的致病過(guò)程。因此，本研究希望能夠通過(guò)大規(guī)模系統(tǒng)的方法將這部分蛋白鑒定出來(lái)，其將為進(jìn)一步的研究病原菌的致病機(jī)理提供研究基礎(chǔ)；病原菌的毒力相關(guān)蛋白通常也是其重要的保護(hù)性抗原，因此本研究所鑒定的細(xì)菌表面蛋白極有可能被開(kāi)發(fā)成為疫苗候選的分子，為解決豬鏈球菌病得防控提供幫助，而本研究也嘗試去評(píng)價(jià)這部分蛋

4、白的保護(hù)效力。現(xiàn)將主要研究結(jié)果報(bào)告如下：
　　 1.豬鏈球菌保護(hù)性抗原HP0197與宿主細(xì)胞之間的相互作用的研究
　　 在本研究前期的工作當(dāng)中，HP0197蛋白已被鑒定為SS2新型的保護(hù)性表面抗原和毒力相關(guān)蛋白。然而該蛋白的生物學(xué)功能尚不清楚，其在致病過(guò)程中的作用還有待于進(jìn)一步證實(shí)。在本研究中，我們?cè)噲D通過(guò)鑒定HP0197與宿主細(xì)胞的相互作用過(guò)程，進(jìn)而為闡明該蛋白的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。首先，我們通過(guò)間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證

5、實(shí)了HP0197能夠與Hep-2細(xì)胞發(fā)生相互作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，這種相互作用可以被肝素和胰酶完全阻斷，其暗示著宿主細(xì)胞表面的類肝素的分子是HP0197的細(xì)胞受體。另外，HP0197還被發(fā)現(xiàn)能夠與葡萄糖相結(jié)合，因此HP0197可能參與著S.suis的能量代謝。為了證實(shí)這個(gè)推測(cè)，我們比較了△hp0197菌株和親本株在不同培養(yǎng)時(shí)期的HPr蛋白的生物學(xué)活性。結(jié)果顯示：當(dāng)hp0197基因缺失后，菌株體內(nèi)的HPr蛋白的磷酸化隨之改變，因此能夠進(jìn)而

6、影響碳代謝調(diào)節(jié)基因CcpA的功能。
　　 2.鑒定豬鏈球菌2型表面蛋白與宿主細(xì)胞表面分子之間的相互作用
　　 病原菌與宿主蛋白質(zhì)之間的相互作用參與著病原菌所有的感染過(guò)程。研究病原菌與宿主之間的相互作用能夠我們?nèi)胬斫饧?xì)菌病的致病機(jī)理。盡管目前這個(gè)領(lǐng)域已有少量的研究，但仍有待于全面的系統(tǒng)鑒定病原菌與宿主之間的蛋白質(zhì)相互作用過(guò)程。在本研究中，我們建立了一種名為基于親和層析的表面蛋白質(zhì)組學(xué)(AffinityChromatogr

7、aphy-based Surface Proteomics；ACSP)的新研究方法，該方法將親和層析技術(shù)和shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)(LC-MS/MS)相結(jié)合，可以用來(lái)大尺度系統(tǒng)的研究病原與宿主之間的相互作用。為了完成ACSP實(shí)驗(yàn)，我們以錨定了天然的Hep-2細(xì)胞表面分子的樹(shù)脂為誘餌，用來(lái)從S.suis表面蛋白中捕獲潛在的互作分子。隨后，我們利用LC-MS/MS技術(shù)從捕獲物中鑒定出40個(gè)潛在的表面互作蛋白，這些蛋白中有3個(gè)蛋白已在前期

8、的研究中被證實(shí)。我們選取了8個(gè)重要的表面互作蛋白，并證實(shí)了其與Hep-2細(xì)胞的粘附作用。另外，3個(gè)新鑒定的表面互作蛋白的重組蛋白以及多克隆抗體能夠顯著的抑制S.suis與Hep-2細(xì)胞的粘附過(guò)程，因此這3個(gè)蛋白極有可能在S。suis與Hep-2細(xì)胞的相互作用過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。通過(guò)使用這個(gè)例子，我們證實(shí)了ACSP技術(shù)是一個(gè)非常有價(jià)值的研究病原菌與宿主相互作用的實(shí)驗(yàn)工具。
　　 3.豬鏈球菌免疫原性蛋白HP0272的保護(hù)力評(píng)價(jià)

9、
　　 S.suis是一個(gè)重要的豬細(xì)菌病病原，其同時(shí)也是一個(gè)人畜共患病病原。開(kāi)發(fā)新的有效疫苗能夠幫助我們控制S.suis的感染。HP0272是一個(gè)細(xì)菌表面免疫原性表面蛋白，其保護(hù)效力有待進(jìn)一步的評(píng)價(jià)。在本研究的小鼠模型當(dāng)中，純化的重組HP0272能夠誘導(dǎo)顯著的抗體水平，并保護(hù)小鼠以抵抗致死劑量的SS2人工感染。另外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR也證實(shí)HP0272為體內(nèi)誘導(dǎo)抗原。該基因在一半的S.suis參考血清型菌株以及大多數(shù)SS2臨床分