豬鏈球菌2型感染宿主后宿主表達(dá)譜的分析研究.pdf

1、豬鏈球菌病是由豬鏈球菌(Streptococcus suis)引起的一種重要的細(xì)菌性傳染病,屬國(guó)家規(guī)定的二類動(dòng)物疫病。豬鏈球菌屬于革蘭氏陽性菌,目前根據(jù)莢膜多糖(CPS)可將豬鏈球菌分為33個(gè)血清型。其中豬鏈球菌2型(Streptococcus suis serotype2,SS2)流行最廣、致病力最強(qiáng),是一種重要的人畜共患傳染病,能引起包括人和豬在內(nèi)的多種動(dòng)物的多種疾病,造成感染甚至死亡,嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展和人類健康。感染豬鏈球菌2

2、型菌能引起豬的敗血癥、腦膜炎、肺炎等病變,并造成突然死亡。人通過接觸病死豬及其副產(chǎn)品經(jīng)傷口、消化道感染豬鏈球菌2型,可引起人鏈球菌中毒休克綜合癥(STSS)和鏈球菌腦膜炎綜合癥(SMS),導(dǎo)致腦膜炎、敗血癥、肺炎、心內(nèi)膜炎、永久性耳聾及突發(fā)性死亡等,死亡率高。1998年夏季,在我國(guó)江蘇省部分地區(qū)爆發(fā)了人感染豬鏈球菌病造成14人死亡；2005年夏季,在四川省的大爆發(fā),造成204人發(fā)病38人死亡,引起了全球?qū)残l(wèi)生的關(guān)注。
　　

3、敗血癥是SS2感染的常見的癥狀,并且能引起高死亡率。研究發(fā)現(xiàn)SS2可以天然寄居在扁桃體中而不發(fā)病,但是在一定的條件下SS2進(jìn)入血液,被單核細(xì)胞吞噬或單獨(dú)存在血液中,通過脈絡(luò)叢運(yùn)送到腦脊液(CSF)中,激發(fā)單核細(xì)胞或吞噬細(xì)胞產(chǎn)生高水平的細(xì)胞因子和趨化因子,導(dǎo)致該部位的炎癥反應(yīng)和腦膜炎。為了研究SS2感染宿主后與宿主單核細(xì)胞的相互作用,本研究選擇人單核細(xì)胞FHP-1細(xì)胞,采用基因芯片的方法研究SS2感染對(duì)人THP-1細(xì)胞的基因表達(dá)譜的變化。

4、
　　 由于SS2感染豬和人之后主要導(dǎo)致腦膜炎、肺炎以及敗血癥等病理變化,為了深入了解其致病機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)選擇人工感染SS2的豬腦組織、肺組織以及外周血單核淋巴細(xì)胞(PBMC)為研究對(duì)象,采用基因芯片的方法研究SS2感染后其基因表達(dá)譜的變化,為進(jìn)一步研究感染機(jī)制和致病機(jī)理提供依據(jù)。具體內(nèi)容如下:
　　 1.人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞感染SS2后表達(dá)譜的變化用SS2感染THP-1細(xì)胞3h,收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組THP-1細(xì)胞,提

5、取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后在體外(IVT)合成cRNA,將cRNA片段化后與AffymetrixGenChip@系列的Human Genome U133 plus2.0基因芯片進(jìn)行雜交,通過洗片、掃描得到表達(dá)譜芯片的各探針的信號(hào)值。通過分析,得到感染了SS2的THP—1細(xì)胞的各個(gè)基因,相比較沒感染SS2的THP-1對(duì)照細(xì)胞,基因的表達(dá)量是否發(fā)生了變化,以及變化的倍數(shù)(Fold Change,FC)。本實(shí)驗(yàn)以p-value小于或等

6、于0.05且FC大于或等于2的基因?yàn)樯险{(diào),p-value小于或等于0.05且FC小于或等于-2的基因?yàn)橄抡{(diào)。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,在此芯片中包含的38500個(gè)人的基因中,有2021個(gè)轉(zhuǎn)錄本p-value小于或等于0.05,篩選出386個(gè)轉(zhuǎn)錄本有顯著性差異表達(dá)變化的基因,通過DAVID在線軟件分析,根據(jù)Gene Ontology(GO)的注釋,328個(gè)基因是已知的,包括了230個(gè)上調(diào)基因和98個(gè)下調(diào)基因。
　　 通過對(duì)這些基因進(jìn)行Gen

7、e Ontology生物學(xué)過程(Biological process)分類,差異表達(dá)基因較多地參與下述生物學(xué)過程:翻譯(Translation)、細(xì)胞因子(Chemokine)、防御/免疫反應(yīng)(Defese/immunity)、泛素.蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasomesystem)、細(xì)胞分裂(Cell division)、凋亡(Apoptosis)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)、代謝(metab

8、olism)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal transduction)、轉(zhuǎn)錄(Transcription)及代謝(Metabolism)等。
　　 利用STRING在線軟件分析這些差異表達(dá)基因合成的蛋白之間的功能關(guān)系,并對(duì)一些蛋白之間的關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)。我們篩選出以INSR、BCL2、CTNNB、UBE2D1和TIF2為中心的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖,主要圍繞在NF-kappa-B信號(hào)通路及其他免疫反應(yīng)途徑相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中。
　　 進(jìn)一步用實(shí)時(shí)

9、熒光定量PCR方法對(duì)其中5個(gè)相關(guān)基因:同源盒基因(homeoboxA4,HOXA4)、CC類趨化因子受體8(chemokine(C-C motif)receptor8,CCR8)、羧肽酶O(carboxypeptidase O,CPO)、RNA聚合酶Ⅱ亞單位2(RNA polymeraseⅡsubunit2,POLR2B)、丙酮酸脫氫酶Elα亞單位基因(pyruvate dehydrogenase(lipoamide)alpha1,PD

10、HA1)、Janus激酶1(Janus kinase1,JAK1)的表達(dá)差異進(jìn)行了驗(yàn)證,得出HOXA4、CCR8、CPO分別上調(diào)2.56、32.94和30.96倍,POLR2B、PDHA1為無變化的0.87和0.76倍,JAK1則下調(diào)0.48倍。而Human Genome U133 plus表達(dá)譜芯片篩出的這幾個(gè)差異表達(dá)基因分別為7.297、7.775、10.52、1、1和0.477倍,與Realtime PCR的結(jié)果基本保持一致。

11、r>　　 2.人工感染SS2的豬腦組織、肺組織及外周血單核淋巴細(xì)胞的表達(dá)譜變化用SS2感染仔豬,24小時(shí)后宰殺,取得對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組仔豬的腦組織、肺組織及全血分離獲得的PBMC。提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后在體外(IVT)合成cRNA,將cRNA片段化后與Affymetrix GenChip@系列的Porcine Genome基因芯片進(jìn)行雜交,通過洗片、掃描得到表達(dá)譜芯片的各探針的信號(hào)值,通過分析得到感染了SS2的豬的腦、肺及P

12、BMC,相比較沒感染SS2的腦、肺及PBMC,基因的表達(dá)量是否發(fā)生了變化,以及變化的倍數(shù)(Fold Change,FC)。本實(shí)驗(yàn)以p-value小于或等于0.05且FC大于或等于2的基因?yàn)樯险{(diào),p-value小于或等于0.05且FC小于或等于-2的基因?yàn)橄抡{(diào)。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,在此芯片中包含的20201個(gè)豬的基因中,腦組織中總共檢測(cè)到1608個(gè)有顯著性差異表達(dá)變化的基因,包含了344個(gè)上調(diào)和1264個(gè)下調(diào)。肺組織中檢測(cè)到617個(gè)有顯著性差

13、異表達(dá)變化的基因,包括293個(gè)上調(diào)和324個(gè)下調(diào)。PBMC中共檢測(cè)到685個(gè)有顯著性差異表達(dá)變化的基因,包括403個(gè)上調(diào)和282個(gè)下調(diào)。在3個(gè)組織中均有有顯著性差異表達(dá)變化的基因有31個(gè),包括了26個(gè)上調(diào)基因和5個(gè)下調(diào)基因。
　　 利用DAVID(Visualization and Integrated Discovery)在線軟件分析,共檢測(cè)到腦中417個(gè)已知的基因。在肺中共檢測(cè)到210個(gè)已知的基因,在PBMC中檢測(cè)到213個(gè)

14、已知的基因。將這些檢測(cè)到的基因進(jìn)行分類,可以知道差異表達(dá)基因主要集中在以下幾個(gè)類別,包括:防御反應(yīng)(defence response)、免疫反應(yīng)(immune response)、炎癥反應(yīng)(inflammatory response)、天然免疫(innate immune rsponse)、細(xì)胞粘附(cell adhesion)、細(xì)胞死亡(cell death)、細(xì)胞分化(cell differentiation)、與信號(hào)傳導(dǎo)關(guān)聯(lián)的細(xì)胞

15、表面受體(cell surface receptor linked signal transduction)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)、細(xì)胞因子結(jié)合(cytokine binding)、對(duì)外界刺激的反應(yīng)(response to external stimuli)、對(duì)刺激的反應(yīng)(response to stimulus)、應(yīng)激反應(yīng)(response to stress)、創(chuàng)傷反應(yīng)(response to woun

16、ding)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性(signaltransducer activity)、基因表達(dá)(gene expression)和生長(zhǎng)因子活性(growth factoractivity)。
　　 進(jìn)一步用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)其中5個(gè)相關(guān)基因:ICAM-1、TLR2、CD163、TTR、VEGFA的表達(dá)差異進(jìn)行了驗(yàn)證。得到結(jié)果ICAM-1、TLR2、CD163在腦中上調(diào)表達(dá)6.00、19.89、179.61倍,TTR和VEGFA下

17、調(diào)-10.92和-4.205倍,而PorcineGenome表達(dá)譜芯片篩出的這幾個(gè)差異表達(dá)基因分別為5.77、3.86、8.91、-12.83和1.55倍。在肺中,上調(diào)基因ICAM-1、TLR2、CD163的表達(dá)分別為55.50、25.59和11.30倍,TTR和VEGFA下調(diào)-7.69和-3.45倍,而表達(dá)譜芯片篩出的這幾個(gè)基因分別為1.97、2.44、4.25、-1.05和-2.22倍。在PBMC中,ICAM-1、TLR2、CD16