家蠶P450基因CYP9A19和CYP9A22的啟動子分析.pdf

1、細胞色素P450酶系是一種廣泛存在于植物、動物、細菌和真菌體內的一種解毒酶系，對藥物、致癌物、除草劑、殺蟲劑及其它環(huán)境有毒物質的代謝過程中起到重要作用。家蠶既是鱗翅目昆蟲研究的模式生物，又是支撐蠶絲產業(yè)的生物基礎，同時也是開發(fā)生物反應器和新型昆蟲產業(yè)的材料。為深入了解家蠶細胞色素P450CYP9A19和CYP9A22兩個基因的誘導表達特征及其啟動子活性開展了研究，主要研究結果如下：
　　 采用雙跟蹤標定定量PCR方法，檢測了家蠶

2、CYP9A19和CYP9A22基因在無誘導及氟化鈉誘導下各個組織中的基因轉錄水平。結果表明：CYP9A19在中腸、絲腺、脂肪體、馬氏管中均有較高水平的表達；CYP9A22在中腸、絲腺、馬氏管中有表達，但在脂肪體中無表達。氟化鈉誘導后隨時間變化的表達模式具有組織特異性，存在中腸、脂肪體先上調再恢復的正向誘導和馬氏管先下調再恢復的反向誘導兩種相反的誘導方向。結果說明：在家蠶P450基因中CYP9A19和CYP9A22與氟化物抗性的相關性密切

3、。
　　 同時在細胞水平上，利用RNA干擾手段通過轉染不同干擾位點片段的方法篩選出干擾效果顯著的siRNA片段。結果表明：Bm-9A19-663和Bm-9A22-1384分別使BmN細胞CYP9A19，CYP9A22基因表達降低到對照的49.5g％和48.00%，這兩個位點分別對兩種基因干擾顯著。當干涉CYP9A19時，CYP9A22基因的表達水平無明顯差異；當干涉CYP9A22時，CYP9A19基因的表達水平卻顯著上調。說明當

4、CYP9A22基因表達明顯下調時，CYP9A19基因表達水平對其有一種補償效應。
　　 家蠶CYP9A19和CYP9A22基因的過量表達與外源環(huán)境有毒物質的代謝有關。為了研究該兩個基因的表達調控機制，對其啟動子區(qū)域進行了功能分析，構建了含熒光素酶報告基因和啟動子不同長度順次缺失片段的重組質粒，和內參載體pRL-TK共轉染BmN細胞，瞬時表達后用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測啟動子活性。分析結果表明：家蠶CYP9A19基因啟動子轉

5、錄起始位點上游-1492～-1102bp這一區(qū)域是重要的轉錄活性區(qū)域；CYP9A22基因啟動子轉錄起始位點上游-1630～-12lObp這一區(qū)域是重要的轉錄活性區(qū)域。0.1×10-2mol/L、0.1×10-3mol/L、0.1×104mol/L的NaF誘導細胞后，其中在0.1×10-3mol/L的NaF條件下，熒光素酶活性增強顯著，表明0.1×10-3mol/LNaF能上調基因的表達。表明受氟化鈉誘導家蠶后CYP9A19和CYP9A2

6、2基因的上調表達與其基因啟動子轉錄活性的升高有一定的關系。本研究為探索家蠶CYP9A19和CYP9A22基因的轉錄調控機理奠定了重要基礎，但其具體功能和作用機制還有待進一步研究。
　　 雙熒光素酶報告系統(tǒng)在啟動子活性方面研究應用廣泛。我們就不同載體大小和構建方法這兩個方面因素對雙熒光素酶系統(tǒng)的影響進行深入研究討論。結果表明，載體越大，轉染效率越低，并得到了一條標準曲線，提出了消除轉染效率差異誤差的標準化方法。另一方面，研究CYP