雙抗蟲基因轉(zhuǎn)化歐美楊107楊的研究.pdf

1、楊樹在全球分布十分廣泛,是重要的造林樹種和生態(tài)防護林樹種。其樹干通直,樹形優(yōu)美,是很好的園林綠化樹種,廣泛應用于園林中,通常做植物造景樹和景觀背景樹。楊樹由于其速生性以及高度的觀賞價值在園林綠化和經(jīng)濟林中得到了越來越廣泛的應用,然而,近年來,病蟲害的侵犯也造成了重大的損失。轉(zhuǎn)雙抗蟲基因歐美楊107楊的獲得不但能有效地解決楊樹的蟲害問題,而且該樹種的速生性也將使其成為園林綠化應用的首選樹種,轉(zhuǎn)雙抗蟲基因歐美楊107楊的獲得不管是從社會需求

2、還是從經(jīng)濟效益上考慮,它的研發(fā)和培育都是必要的。目前,在楊樹的眾多樹種中,只有白楊派樹種在組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化方面相對成熟。本試驗主要采用農(nóng)桿介導法將構建在一個載體上的雙抗蟲基因(BtCrylAc基因+API慈姑蛋白酶抑制劑基因)對歐美楊107楊進行遺傳轉(zhuǎn)化研究,并對轉(zhuǎn)基因植株進行了分子生物學檢測和初步飼蟲試驗,獲得了轉(zhuǎn)雙抗蟲基因的歐美楊107楊株系。
　　 (1)針對影響歐美楊107楊的遺傳轉(zhuǎn)化的不同因素,初步建立了歐美楊107

3、楊品種高效組織培養(yǎng)再生體系及遺傳轉(zhuǎn)化體系,以材料的莖段和葉片為外植體,通過篩選獲得最佳分化培養(yǎng)基,建立了其穩(wěn)定高效的再生體系,結果表明:不定芽誘導分化最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+IAA0.15mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂7g/L,確定生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.5mg/L+蔗糖15g+瓊脂7g/L。同時研究結果表明:葉片主葉脈及葉柄和莖段傷口處發(fā)芽狀況相似,因此選取葉片或莖段作為試驗材料對本次試驗影響不大。

4、　　 (2)采用農(nóng)桿菌介導法進行基因轉(zhuǎn)化,對影響轉(zhuǎn)化的各個因素進行了優(yōu)化研究。結果表明:在浸菌15min,共培養(yǎng)3d,得到抗性芽,誘導率為16.7％。經(jīng)過卡那霉素的篩選,生根培養(yǎng),煉苗和移栽,獲得抗性植株。
　　 (3)根據(jù)PCR分析及ELISA毒蛋白檢測結果,證明Bt基因和蛋白酶抑制劑基因已經(jīng)整合到歐美楊107楊基因組DNA中。通過本試驗的研究,獲得了轉(zhuǎn)雙抗蟲基因的歐美楊107楊10個系號,其中10個系號進行PCR檢測都為陽

5、性,ELISA檢測10個系號中毒蛋白含量測定占總蛋白最高表達量為0.0336%。
　　 (4)用轉(zhuǎn)基因歐美楊107楊的幼嫩葉片喂養(yǎng)美國白蛾1齡幼蟲的蟲試結果表明,轉(zhuǎn)雙抗蟲基因歐美楊107楊對幼蟲的毒殺率明顯高于對照未轉(zhuǎn)基因楊樹,6個編號的植株葉片被美國白蛾取食后,其中4個號系死亡率能達到100%。說明這2個基因在植物細胞內(nèi)均能夠有效地表達,其表達產(chǎn)物對美國白蛾幼蟲具有較強的毒性。
　　 (5)經(jīng)分子生物學檢測和蟲試效果,