水稻miR319的耐冷功能分析與分子機(jī)制研究.pdf

1、低溫是影響水稻生產(chǎn)的重要環(huán)境限制因素之一，其中苗期冷害會使植株枯黃、分蘗減少，嚴(yán)重時(shí)可引起植株生長發(fā)育遲緩，進(jìn)而導(dǎo)致減產(chǎn)或絕收。了解水稻苗期冷害發(fā)生的分子機(jī)制，改良水稻的耐冷性和培育耐冷水稻新品種是解決低溫對水稻生產(chǎn)影響的關(guān)鍵。植物耐受低溫脅迫是一個(gè)系統(tǒng)的調(diào)控過程，需要眾多基因參與。microRNA是長度為21nt左右的單鏈RNA分子，被證明參與許多生物學(xué)過程的調(diào)控。miR319被證明參與植物生長發(fā)育的調(diào)控，我們在前期的研究中，通過基因

2、芯片分析發(fā)現(xiàn)，水稻miR319a/b在冷脅迫下差異表達(dá)，推測miR319a/b在水稻耐受低溫脅迫時(shí)發(fā)揮作用。本研究對水稻幼苗進(jìn)行低溫脅迫處理，采用半定量RT-PCR方法，分析miR319表達(dá)特性，驗(yàn)證前期基因芯片分析結(jié)果。構(gòu)建pre-miR319a/b植物表達(dá)載體，對水稻進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了pre-miR319a及miR319b超量表達(dá)水稻植株。對野生型水稻和過量表達(dá)植株進(jìn)行脅迫處理研究miR319耐冷功能。利用psRNA Target

3、軟件預(yù)測miR319靶基因，并利用miR319b過量表達(dá)植株進(jìn)行real-time PCR驗(yàn)證其靶基因。采用real-time RT-PCR方法，分析冷脅迫Marker基因表達(dá)，初步闡明miR319b調(diào)控植物耐冷的分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：
　　 ⑴水稻冷脅迫相關(guān)miRNA的驗(yàn)證。通過冷脅迫處理下的RT-PCR結(jié)果分析，miR319a/b在冷脅迫0.5h時(shí)下調(diào)表達(dá)，隨著處理時(shí)間的增加表達(dá)量有所升高，在3h時(shí)以后，miR319a

4、/b的表達(dá)量繼而下降。RT-PCR驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)室前期的芯片研究結(jié)果，顯示了miR319a與miR319b是對冷脅迫具有響應(yīng)。
　　 ⑵miR319在水稻中的過量表達(dá)及耐冷功能分析。構(gòu)建了融合有pre-miR319a/b的植物表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的方法對水稻愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。通過PCR、southern blot、RT-PCR對抗性植株進(jìn)行了分子生物學(xué)檢測，每個(gè)基因得到轉(zhuǎn)基因植株3株以上，并利用stem-loop

5、 qRT-PCR檢測miR319a/b成熟體在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)量，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)pre-miR319a基因植株miR319a表達(dá)量基本無變化；轉(zhuǎn)pre-miR319b基因植株中miR319b的表達(dá)量明顯提高。通過分析T2轉(zhuǎn)基因及野生型植株在冷脅迫處理下的表型，結(jié)果表明：pre-miR319a轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株種子大小及在萌發(fā)1d-15d各階段均無差異：在冷處理后，轉(zhuǎn)基因水稻與野生型水稻的生長狀況無明顯區(qū)別。miR319b過量表達(dá)水稻的

6、種子比野生型小，且萌發(fā)后15d幼苗miR319b過量表達(dá)植株明顯比野生型植株低矮，第一片真葉至第二片真葉之間的節(jié)間變短，但是植株的生長并沒有受到抑制；三葉期時(shí)，miR319b基因提高了水稻的耐冷性，成活率明顯升高，脯氨酸含量升高。
　　 ⑶水稻miR319靶基因的預(yù)測及生物學(xué)驗(yàn)證。通過miRNA靶基因預(yù)測軟件工具psRNA Target，我們預(yù)測得到了26個(gè)miR319的靶基因；通過對過表達(dá)植株的定量分析驗(yàn)證了其中兩個(gè)靶基因：O

7、s＿03g57190(PCF6)和Os＿07g05720(OsTCP21)，這兩個(gè)基因均屬于TCPs轉(zhuǎn)錄因子家族。在已有的研究報(bào)道中，TCPs轉(zhuǎn)錄因子可以促進(jìn)植物細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的分化。
　　 ⑷miR319b介導(dǎo)的冷脅迫應(yīng)答分子機(jī)制。通過對miR319b過表達(dá)植株與野生型植株冷脅迫相關(guān)Maker基因定量分析，我們發(fā)現(xiàn)在冷脅迫下一些關(guān)鍵的Maker基因如DREB/CBF類基因、TPPs等在過表達(dá)植株中上調(diào)表達(dá)，而OsCPT1

8、基因下調(diào)表達(dá)。TPPs基因受冷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，可以直接的提高水稻的冷脅迫能力。DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子類基因在過量表達(dá)植株中轉(zhuǎn)錄水平提高，可以促使該類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，誘導(dǎo)下游冷脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)，提高水稻的耐冷性。miR319通過間接調(diào)控這些基因的表達(dá)，提高植物的冷脅迫耐性。OsCPT1基因一個(gè)是的DREB1A轉(zhuǎn)錄因子的靶基因。在OsMYB3R-2過量表達(dá)植株中，該基因在冷脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)，脯氨酸含量升高，提高轉(zhuǎn)OsMYB3R-2基因植株的