piggyBac轉(zhuǎn)座子亞末端對轉(zhuǎn)座活性的影響.pdf

1、piggyBac轉(zhuǎn)座子屬于DNA型轉(zhuǎn)座子，具有插入并且精確切離靶位點特性，是目前轉(zhuǎn)基因研究中應(yīng)用最廣泛的工具之一，目前對于piggyBac類轉(zhuǎn)座子的研究主要集中在不同生物體中新型轉(zhuǎn)座子及其應(yīng)用范圍的探索，而對于轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系的研究卻較少。本文試圖在不同細胞寄主與活體寄主中利用不同組合重組載體探索亞末端對piggyBac轉(zhuǎn)座活性的影響，現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)如下:
　　1、以來自棉鈴蟲HaPLE和來自銀紋夜蛾AaPLE的轉(zhuǎn)座酶，構(gòu)建了H

2、elper輔助質(zhì)粒，并利用二元轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，在果蠅S2細胞中檢測了這兩種轉(zhuǎn)座酶對不同末端重復(fù)序列和亞末端重復(fù)序列組合的重組供體質(zhì)粒的剪切活性。結(jié)果顯示，AaPLE轉(zhuǎn)座酶不具備活性，但HaPLE可以識別自身末端反向重復(fù)序列與赤擬谷盜亞末端反向重復(fù)序列組合的重組供體，這表明HaPLE轉(zhuǎn)座酶具有明顯的轉(zhuǎn)座活性，它可以識別自身末端反向重復(fù)序列與適宜亞末端反向重復(fù)序列構(gòu)建的供體質(zhì)粒，但剪切的精確性可能受到亞末端的影響。
　　2、通過不同亞末端替

3、換構(gòu)建供體，在果蠅S2細胞中檢測了小地老虎AyPLE和棉蚜AgPLE的轉(zhuǎn)座酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AyPLE、AgPLE對所試供體質(zhì)粒均有顯著的剪切活性，不同亞末端對轉(zhuǎn)座活性有一定影響，但統(tǒng)計差異不顯著。這揭示了轉(zhuǎn)座酶可能存在適應(yīng)不同亞末端的自身調(diào)控機制。此外，也可能是由于所選亞末端種類較少，未能檢測出亞末端的顯著影響。
　　3、利用Helper/Donor二元轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在倉鼠腎上皮細胞BHK中檢測了來自粉紋夜蛾IFP2、小地老虎AyPLE

4、和棉蚜AgPLE轉(zhuǎn)座酶對不同亞末端供體的剪切活性。結(jié)果顯示，在BHK細胞中AyPLE轉(zhuǎn)座酶可以識別剪切來自小地老虎末端反向重復(fù)序列與紅鈴蟲亞末端反向重復(fù)序列組合的重組供體Ay-Pg，AgPLE轉(zhuǎn)座酶與來自棉蚜末端反向重復(fù)序列與赤擬谷盜亞末端反向重復(fù)序列組合的重組供體Ag-Tc，以及來自棉蚜末端反向重復(fù)序列與粉紋夜蛾亞末端反向重復(fù)序列組合的重組供體Ag-d共轉(zhuǎn)染均能產(chǎn)生近似精確剪切條帶。綜合在果蠅S2細胞的分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)座酶剪切精確性受

5、寄主細胞和亞末端反向重復(fù)序列共同影響。
　　4、利用Helper/Donor二元轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在和顯微注射技術(shù)在不同昆蟲中檢測IFP2、AyPLE和AgPLE轉(zhuǎn)座酶對不同亞末端重組供體剪切活性。結(jié)果顯示:研究同綱同目不同種宿主亞末端是否會影響轉(zhuǎn)座子對不同重組供體精確剪切活性。結(jié)果顯示:IFP2轉(zhuǎn)座子在實驗所選取的這幾類昆蟲中都具有精確剪切活性，AyPLE、AgPLE轉(zhuǎn)座子在不同昆蟲都只能產(chǎn)生非精確剪切，這可能和AyPLE、AgPLE轉(zhuǎn)座