桿狀病毒泛素基因的進化與BmNPV泛素基因的特性研究.pdf

1、家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）為雙鏈DNA病毒，其基因組共含有143個開放閱讀框（Open reading frame，ORF），是家蠶的主要病原體。BmNPV泛素基因（ubiquitin）編碼一個由77個氨基酸組成的小分子蛋白。桿狀病毒是目前已知的僅有的含有泛素基因的病毒，而在真核生物中，泛素是一個廣泛存在且十分重要的小分子蛋白，在細胞凋亡、蛋白的特異性降解、細胞分化

2、等眾多方面都有著十分重要的作用。目前對于桿狀病毒泛素基因的研究尤其是BmNPV的泛素基因(vub)的研究還較少，本研究從生物信息學(xué)，轉(zhuǎn)錄時相，表達時相，基因的敲除、拯救與替換，49種桿狀病毒與16種昆蟲宿主泛素基因的差異與進化等方面對BmNPV泛素做了基礎(chǔ)性的研究，為桿狀病毒泛素基因的后續(xù)研究提供了研究基礎(chǔ)，具體研究結(jié)果如下:
　　(1)生物信息學(xué)分析顯示，BmNPV泛素蛋白(VUB)由77個氨基酸殘基組成，預(yù)測分子量約為8.65

3、kDa，等電點為6.56。該蛋白并無信號肽區(qū)域，亞細胞定位預(yù)測表明該蛋白在宿主細胞的細胞質(zhì)與細胞核當(dāng)中均有分布。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示VUB為一個球狀結(jié)構(gòu)，包含了3個α-螺旋和5個β-折疊，該結(jié)構(gòu)與所預(yù)測的家蠶泛素蛋白三維結(jié)構(gòu)十分相似。
　　(2)通過原核表達系統(tǒng)對vub進行分子克隆并進行原核表達，大量誘導(dǎo)VUB的表達，并對目的蛋白進行純化切割，成功制備多克隆抗體。驗證所制備抗體的特異性與效價較高，可以滿足后續(xù)實驗的需要。
　　(

4、3)轉(zhuǎn)錄時相與表達時相分析均表明vub為極晚期基因，但是該基因在BmN細胞中的轉(zhuǎn)錄時間比在家蠶中腸組織中的轉(zhuǎn)錄時間提前了約24小時。此外，表達時相分析表明，vub可能參與了家蠶細胞中的UPP途徑。三種不同品系家蠶(NB、306、BC8)中腸組織中vub的表達出現(xiàn)了比較明顯的差異，這暗示vub可能與家蠶抗病毒機制有一定的關(guān)系，具體機制有待進一步研究。
　　(4)構(gòu)建重組Bacmid并轉(zhuǎn)染BmN細胞，通過熒光報告蛋白EGFP觀察病毒的

5、轉(zhuǎn)染增殖情況，并通過TCID50分析來確定vub的缺失是否像AcMNPV泛素基因缺失一樣，導(dǎo)致BV的產(chǎn)量有大幅度下降。結(jié)果顯示，不論何種重組Bacmid，轉(zhuǎn)染細胞后所觀察到的熒光現(xiàn)象基本一致，并未出現(xiàn)明顯差異，說明vub的缺失并不會影響病毒基因組的復(fù)制。
　　(5)進化分析結(jié)果顯示，泛素基因在昆蟲宿主和桿狀病毒中都受到了很強的純化選擇壓力，且昆蟲宿主泛素基因所受到的純化選擇壓力要比桿狀病毒泛素基因更大，即昆蟲泛素進化更為保守。系統(tǒng)