豬肺炎支原體mhp168_218、mhp168_366、mhp168_477基因的克隆表達(dá)、純化及免疫原性研究.pdf

1、豬支原體肺炎(Mycoplasma pneumoniae of swine，MPS)是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyoneumoniae，Mhp）引起的一種豬的慢性呼吸道疾病，該病廣泛存在于世界各地。我國(guó)對(duì)該病的血清流行病學(xué)監(jiān)測(cè)顯示，超過95％的豬場(chǎng)均為Mhp血清陽性。然而目前的疫苗免疫效果較差，研發(fā)具有免疫保護(hù)效果的Mhp疫苗就成為Mhp研究的核心內(nèi)容之一。病原菌的外膜蛋白和分泌蛋白在病原菌的致病過程中通常能夠與宿主細(xì)胞直

2、接接觸，觸發(fā)宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)。因此，外膜蛋白和分泌蛋白通常作為疫苗抗原的候選靶標(biāo)。本課題通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了Mhp的部分外膜蛋白和分泌蛋白，并將這些進(jìn)行了原核表達(dá)和純化，這為后續(xù)的抗原篩選提供了篩選靶標(biāo)。
　　1.Mhp168_218、Mhp168_366、Mhp168_477蛋白的生物信息學(xué)分析
　　目的:通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)Mhp168_218、Mhp168_366、Mhp168_477的亞細(xì)胞定位。
　

3、　方法:將Mhp168菌株的mhp168_218、mhp168-366和mhp168-477堿基序列及編碼蛋白的氨基酸序列與Mhp232、J株、Mhp7422株和Mhp7448株的基因序列及氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，分析三個(gè)基因核苷酸序列及相應(yīng)蛋白氨基酸序列的保守性。利用SignalP4.1軟件和LipoP1.0軟件預(yù)測(cè)三個(gè)蛋白的信號(hào)肽序列;利用DAS軟件分別預(yù)測(cè)三個(gè)蛋白的跨膜區(qū);利用CELLO version2.5預(yù)測(cè)三個(gè)蛋白的亞

4、細(xì)胞定位。
　　結(jié)果:mhp168_218基因的堿基序列保守性在98％以上，編碼蛋白的氨基酸序列保守性約為99％，含有信號(hào)肽序列，可能存在8個(gè)跨膜區(qū)，可能為外膜蛋白或分泌蛋白;mhp168_366基因的堿基序列保守性在98％以上，編碼蛋白的氨基酸序列保守性為96％-98％，不含有信號(hào)肽序列，存在4個(gè)跨膜區(qū)，可能為外膜蛋白或分泌蛋白;mhp168_477基因的堿基序列保守性在98％以上，編碼蛋白的氨基酸序列保守性超過99％，不含有信

5、號(hào)肽序列，存在4個(gè)跨膜區(qū)，可能為外膜蛋白或周質(zhì)蛋白。
　　結(jié)論:根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，Mhp168_218、Mhp168_366、Mhp168_477均可能為外膜蛋白，可作為疫苗候選蛋白抗原。
　　2.mhp168_218基因分段表達(dá)與蛋白純化
　　目的:mhp168_218基因分段原核表達(dá)，獲得高純度具有良好天然構(gòu)象的重組目的蛋白。
　　方法:將mhp168_218基因分為4段，分別命名mhp168_218-

6、1、mhp168_218-2、mhp168_218-3和mhp168_218-4。將不存在編碼色氨酸的TGA的mhp168_218-1、mhp168_218-3和mhp168_218-4基因片段直接連接pGEX-6p-2載體;將存在編碼色氨酸的TGA的mhp168_218-2基因片段連接pMD19-T載體后TGA突變?yōu)門GG，再將突變后的mhp168_218-2基因片段連接pGEX-6p-2載體。將4個(gè)連接pGEX-6p-2載體的重組質(zhì)

7、粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，后用谷胱甘肽Beads純化得到融合蛋白，利用PreScission protease酶切純化蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)情況與純化效果。
　　結(jié)果:經(jīng)測(cè)序表明mhp168_218-2基因片段突變成功，融合GST標(biāo)簽的Mhp168_218-1、Mhp168_218-2、Mhp168_218-3和Mhp168_218-4重組蛋白能夠以可溶形式表達(dá)，大小

8、分別為41kDa、59 kDa、40 kDa和58 kDa，且這些重組蛋白均能被谷胱甘肽Beads純化。Mhp168_218-2重組蛋白可被PreScission protease酶切，獲得不攜帶GST標(biāo)簽的33 kDa的Mhp168_218-2目的蛋白。
　　結(jié)論:Mhp168_218-1、Mhp168_218-2、Mhp168_218-3和Mhp168_218-4蛋白能以具有良好天然構(gòu)象的可溶形式在大腸桿菌XL-1中表達(dá)，并被

9、谷胱甘肽Beads純化。Mhp168_218-2重組蛋白能夠被PP酶切去GST標(biāo)簽，得到Mhp168_218-2可溶性目的蛋白。
　　3.mhp168_366與mhp168_477基因的原核表達(dá)及純化
　　目的:mhp168_366、mhp168_477基因原核表達(dá)，獲得高純度具有良好天然構(gòu)象的重組目的蛋白。
　　方法:將mhp168_366與mhp168_477基因分別連接到pMD19-T克隆載體，將編碼色氨酸的mh

10、p168_366基因中的4個(gè)TGA及mhp168_477基因中3個(gè)TGA均突變?yōu)門GG，連接pGEX-6p-2表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化E.coli XL-1感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)0.2mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，后用谷胱甘肽Beads純化得到融合蛋白，利用PreScissionprotease酶切純化蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)情況與純化效果。
　　結(jié)果:經(jīng)測(cè)序表明mhp168_366與mhp168_477基因片段突變成功，融合GST標(biāo)

11、簽的Mhp168_366和Mhp168_477重組蛋白能夠以可溶形式表達(dá)，大小分別為45.1KDa和59.8KDa。
　　結(jié)論:Mhp168_366、Mhp168_477蛋白能以可溶形式在大腸桿菌XL-1中表達(dá)，并被谷胱甘肽Beads純化。
　　4.6個(gè)蛋白免疫活性的研究
　　目的:檢測(cè)6個(gè)蛋白的免疫原性和反應(yīng)原性。
　　方法:將純化后的融合蛋白分別免疫小鼠，并以純化后融合蛋白為包被抗原建立間接ELISA檢測(cè)方法

12、，檢測(cè)各個(gè)蛋白抗血清的抗體效價(jià)。利用Mhp陽性血清對(duì)純化后融合蛋白進(jìn)行Western-blot試驗(yàn)檢測(cè)。
　　結(jié)果:間接ELISA檢測(cè)結(jié)果Mhp168_218-1、Mhp168_218-2、Mhp168_218-3、Mhp168_218-4、Mhp168_366和Mhp168_477蛋白的抗血清具有較高的抗體效價(jià)，其P/N值的平均值分別是2.74、2.34、2.83、2.40、2.67和2.37。Western-blot試驗(yàn)結(jié)果顯