Enterobacter cloacae Z0206富硒多糖對動物生長性能和免疫功能的影響及其作用機制研究.pdf

1、本課題組前期從自然界分離、篩選并馴化得到一株高產(chǎn)胞外多糖細菌菌株Enterobacter cloacae Z0206，該菌株不僅多糖產(chǎn)量高，而且對硒有較強的耐受能力，在含有無機硒的培養(yǎng)基上生長可以將無機硒轉(zhuǎn)化為硒多糖(Se-ECZ-EPS)，Se-ECZ-EPS含硒量為535.7mg/kg。初步生物學功能研究發(fā)現(xiàn)，Se-ECZ-EPS可以提高小鼠的細胞和體液免疫功能，改善環(huán)磷酰胺引起的小鼠免疫抑制，在細胞水平上發(fā)現(xiàn)Se-ECZ-EPS對

2、H2O2引起的小鼠巨噬細胞RAW264.7的氧化損傷具有保護作用。
　　本研究擬在前期研究Se-ECZ-EPS可以改善小鼠免疫功能的基礎(chǔ)上，探討Se-ECZ-EPS在動物養(yǎng)殖生產(chǎn)中的免疫調(diào)節(jié)作用，為將其開發(fā)成潛在的動物免疫調(diào)節(jié)制劑奠定基礎(chǔ)。本研究設(shè)計了四個試驗:試驗一，首先采用小鼠急性經(jīng)口毒性試驗進行了Se-ECZ-EPS在動物中使用的的安全性評價。試驗二，在確定了Se-ECZ-EPS在動物上的使用安全性后，為了拓展其在水產(chǎn)及畜禽

3、養(yǎng)殖動物上的應(yīng)用，選擇水產(chǎn)甲殼類的理想模式動物-螯蝦為試驗對象，研究了Se-ECZ-EPS對螯蝦的免疫調(diào)節(jié)功能及對感染白斑病毒后的保護作用;試驗三，在水產(chǎn)豐豐螯蝦研究基礎(chǔ)上深入探討了Se-ECZ-EPS對家禽動物-肉仔雞的促生長及免疫調(diào)節(jié)作用;試驗四，進一步選擇斷奶仔豬為試驗對象，深入研究了Se-ECZ-EPS對斷奶仔豬生長性能、免疫功能、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及腸道微生物多樣性的影響并探討其生物學機制;通過以上研究為Se-ECZ-EPS在動物中

4、的應(yīng)用奠定了堅實理論基礎(chǔ)。
　　試驗一、Z0206富硒多糖的安全性評價
　　為了奠定Z0206富硒多糖在水產(chǎn)及畜禽養(yǎng)殖動物上應(yīng)用的基礎(chǔ)，本研究首先采用小鼠急性經(jīng)口毒性試驗驗證其在動物上的使用安全性。試驗結(jié)果顯示，受試小鼠急性經(jīng)口毒性試驗雌、雄兩性別最大耐受量均大于20.0g/kg體重，依據(jù)GB15193.4-2003《食品安全性毒理學評價程序和檢驗方法-急性毒性試驗》表明Se-ECZ-EPS無毒，為其在水產(chǎn)動物、畜禽動物上的

5、應(yīng)用提供了可能性。
　　試驗二、Z0206富硒多糖對水產(chǎn)動物螯蝦免疫功能的影響
　　在確定Se-ECZ-EPS在動物上的使用安全性基礎(chǔ)上，以水產(chǎn)甲殼類的理想模式動物-克氏原螯蝦(Procambarus clarkii(Girard))為動物模型，通過注射1μg g-1 Se-ECZ-EPS，測定免疫相關(guān)指標和基因表達，同時探討Se-ECZ-EPS對螯蝦感染自斑病毒后的保護作用。研究結(jié)果顯示，在注射Se-ECZ-EPS24，4

6、8和72h后，螯蝦血液中酚氧化酶(PO)，呼吸爆發(fā)(RB)和超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著升高(P＜0.05);基因表達結(jié)果顯示，在注射Se-ECZ-EPS24和48h后，絲氨酸蛋白酶、HSP70和Mn-SOD基因表達顯著上調(diào)，而酚氧化酶在24到72h后無顯著影響;14天的攻毒試驗表明，注射Se-ECZ-EPS后能夠顯著提高螯蝦感染W(wǎng)SSV后的存活率（對照組:0％、Se-ECZ-EPS組:59.7％）。綜上結(jié)果揭示，Se-ECZ-EP

7、S可以提高克氏原螯蝦的免疫功能，是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑。
　　試驗三、Z0206富硒多糖對肉仔雞生長性能、免疫功能及腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響
　　在研究了Se-ECZ-EPS對螯蝦的免疫調(diào)節(jié)功能及感染白斑病毒后的保護作用基礎(chǔ)上，繼而深入探討Se-ECZ-EPS在家禽養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位的另一種動物-肉仔雞上的促生長及免疫調(diào)節(jié)作用。
　　3.1.Z0206富硒多糖對肉仔雞生長性能、胴體品質(zhì)的影響
　　試驗選取1日齡艾維茵

8、肉仔雞240羽，隨機分為5個處理，每個處理4個重復(fù)，每個重復(fù)12羽。對照組在基礎(chǔ)日糧中以亞硒酸鈉的形式添加0.15 mg/kg的硒水平，四個試驗組在基礎(chǔ)日糧中分別添加280、560、840、1120 mg/kg的Z0206Se-ECZ-EPS（四個試驗組硒含量分別為0.15、0.30、0.45、0.60 mg/kg）。結(jié)果顯示:與對照組相比，添加840、1120 mg/kg的Se-ECZ-EPS可以顯著提高肉仔雞0-6周平均日增重，顯著

9、降低料重比(P＜0.05);添加560 mg/kg、840 mg/kg、1120 mg/kg Se-ECZ-EPS則顯著降低了胸肌、腿肌的滴水損失(P＜0.05)，而對肌肉pH無顯著性影響。結(jié)果表明Se-ECZ-EPS可以降低雞肉的滴水損失，有效提高肉仔雞的生長性能。
　　3.2.E.cloacae Z0206富硒多糖對肉仔雞免疫功能的影響
　　肉仔雞免疫功能研究結(jié)果顯示:血清抗氧化指標方面:與對照組和280 mg/kgSe

10、-ECZ-EPS組相比，添加840mg/kg和1120mg/kg的Se-ECZ-EPS可顯著增加抗氧化酶GSH-Px、SOD的活性，顯著降低MDA的含量(P＜0.05)。細胞因子含量方面:添加280mg/kg、560mg/kg、840 mg/kg和1120 mg/kg的Se-ECZ-EPS均能顯著提高血清TNF-α和IL-2的濃度（P＜0.05），同時，560mg/kg和1120 mg/kgSe-ECZ-EPS組血清IL-6的水平亦顯著

11、提高(P＜0.05)?？贵w水平方面:添加840mg/kg和1120 mg/kg的Se-ECZ-EPS顯著提高了21、35日齡血清新城疫HI水平（P＜0.05），而在42日齡，只有840 mg/kg組新城疫HI水平顯著升高(P＜0.05);此外，添加1120 mg/kg的Se-ECZ-EPS能顯著提高免后7d、14d血清禽流感抗體水平（P＜0.05）。提示Se-ECZ-EPS可以通過增強抗氧化酶活性、促進血清細胞因子分泌、提高血清抗體水平

12、來增強免疫功能，進而提高肉仔雞的生長性能。
　　3.3.E.cloacae Z0206富硒多糖對肉仔雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響
　　肉仔雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)研究結(jié)果顯示:添加560 mg/kg和840 mg/kg的Se-ECZ-EPS顯著降低了十二指腸隱窩深度，顯著提高了十二指腸絨毛高度和隱窩深度比VCR(P＜0.05)，而添加1120 mg/kg的Se-ECZ-EPS顯著提高了空腸絨毛高度（P＜0.05）。提示Se-ECZ-EPS改善

13、了肉仔雞腸道的形態(tài)結(jié)構(gòu)，有利于養(yǎng)分物質(zhì)的吸收，進而提高肉仔雞的生長性能。
　　試驗四、Z0206富硒多耱?qū)嗄套胸i生長性能、免疫功能、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及腸道微生物多樣性的影響
　　在研究Se-ECZ-EPS對肉仔雞促生長、增強免疫功能、改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，進一步選擇在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位的斷奶仔豬為試驗對象，探討Se-ECZ-EPS對斷奶仔豬生長性能、免疫功能、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及腸道微生物多樣性的影響及其作用機制。

14、　　4.1.Z0206富硒多糖對斷奶仔豬生長性能的影響
　　試驗選擇150頭28日齡“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬，隨機分成5組:對照組（基礎(chǔ)日糧）、Na2SeO3組（基礎(chǔ)日糧+0.30 mg/kg Na2SeO3）、Na2SeO3+APS組（基礎(chǔ)日糧+0.30 mg/kg Na2SeO3+560 mg/kg黃芪多糖）、Na2SeO3+EPS組（基礎(chǔ)日糧+0.30 mg/kg Na2SeO3+560 mg/kg Z0206多糖）、

15、Se-ECZ-EPS組（基礎(chǔ)日糧+560 mg/kg Z0206富硒多糖）。結(jié)果顯示，日糧中添加Na2SeO3+APS、Na2SeO3+EPS、Se-ECZ-EPS顯著提高斷奶仔豬平均日增重(P＜0.05)，且Se-ECZ-EPS組顯著高于Na2SeO3組(P＜0.05)，而與Na2SeO3+APS、Na2SeO3+EPS組無顯著性差異;Na2SeO3+EPS、Se-ECZ-EPS組料重比顯著低于對照組和Na2SeO3組(P＜0.05)

16、，與Na2SeO3+EPS組無顯著性差異。結(jié)果提示:Se-ECZ-EPS可以促進斷奶仔豬的生長性能，使用效果與黃芪多糖APS相當。
　　4.2.Z0206富硒多糖對斷奶仔豬免疫功能的影響
　　斷奶仔豬免疫功能結(jié)果顯示，在抗氧化功能方面:與對照組相比，日糧中添加Na2SeO3+EPS、Se-ECZ-EPS顯著提高仔豬血清總抗氧化力(T-AOC)(P＜0.05)、顯著降低了血清丙二醛(MDA)含量(P＜0.05)。此外，Se-E

17、CZ-EPS組血清谷胱甘肽還原酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著提高了(P＜0.05)，而與Na2SeO3+APS、Na2SeO3+EPS組相比沒有顯著性差異。細胞因子方面:日糧中添加Na2SeO3+EPS、Se-ECZ-EPSS顯著提高了仔豬血清TNF-α、IL-2、IL-6含量(P＜0.05)，而與Na2SeO3+APS組相比沒有顯著性差異。免疫球蛋白方面:相比于對照組和Na2SeO3組，日糧中添加Se-ECZ-E

18、PS顯著提高了仔豬血清IgG、IgM含量，且Se-ECZ-EPS組IgM含量顯著高于Na2SeO3+APS組(P＜0.05)。組織抗菌肽表達方面:Na2SeO3+APS組、Na2SeO3+EPS組、Se-ECZ-EPS組顯著提高了肝臟抗菌肽基因PR-39、Hepcidin的表達(P＜0.05);且Se-ECZ-EPS顯著提高了十二指腸中pBD-1的基因表達，提高了空腸和回腸中pBD-2的基因表達(P＜0.05);而Na2SeO3+EPS

19、提高了空腸和回腸中pBD-2的基因表達（P＜0.05），Na2SeO3+APS只提高了回腸中pBD-2的基因表達（P＜0.05）。結(jié)果提示:Se-ECZ-EPS可以通過提高血清免疫球蛋白含量、促進細胞因子分泌、提高肝臟和腸道抗菌肽基因表達來增強免疫功能。
　　4.3.Z0206富硒多糖對斷奶仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及腸道微生物多樣性的影響
　　斷奶仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及腸道微生物多樣性研究結(jié)果顯示:斷奶仔豬日糧中添加Na2SeO3+EP

20、S、Se-ECZ-EPS顯著提高了十二指腸、空腸絨毛高度和隱窩深度比VCR(P＜0.05)，明顯增加空腸絨毛高度(P＜0.05)。腸道微生物多樣性分析顯示，Se-ECZ-EPS可以提高結(jié)腸、盲腸內(nèi)容物中微生物多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)），與Na2SeO3組相比，添加Se-ECZ-EPS能夠增加結(jié)腸、盲腸中革蘭氏陽性菌（厚壁菌門）比例，減少革蘭氏陰性菌（擬桿菌門）比例。結(jié)果提示:Z0206富硒多糖可以改善腸道結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)菌群平衡，進而提