29418.ssdna介導(dǎo)的自組裝脫氫酶催化偶聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)輔酶高效循環(huán)利用的研究

1、UDC：華東理工大學(xué)學(xué)位論文ssDNA介導(dǎo)的自組裝脫氫酶催化偶聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)輔酶高效循環(huán)利用的研究馬飛指導(dǎo)教師姓名：馬興元教授華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)名稱：藥學(xué)一級(jí)學(xué)科論文定稿日期：20140526論文答辯同期：20140523學(xué)位授予單位：華東理T大學(xué)學(xué)位授予日期：201l哿6月20日答辯委員會(huì)主席：評(píng)閱人：葉邦策教授張惠展教授彭華松副教授華東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文第1頁(yè)ssDNA介導(dǎo)的自組裝脫氫酶催化偶聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)輔酶高

2、效循環(huán)利用的研究摘要脫氫酶作為一種氧化還原酶，在六大類酶學(xué)分類中屬于第一類，在生物傳感器、輔酶再生、多酶催化等方面具有廣泛的應(yīng)用。為j，建立脫氫酶偶聯(lián)催化體系，實(shí)現(xiàn)輔酶高效循環(huán)再生，我們進(jìn)行了從基本性質(zhì)到應(yīng)用層面的一系列研究。論文的研究?jī)?nèi)容涉及一種脫氫酶的鑒定和表征，脫氫酶與ssDNA高效交聯(lián)反應(yīng)體系的建立和ssDNA介導(dǎo)脫氫酶偶聯(lián)反應(yīng)方法實(shí)現(xiàn)輔酶循環(huán)的研究。主要工作包括三個(gè)部分：1、對(duì)源于EcoliMGl655由orf382編碼被注釋

3、為脫氫酶的蛋白質(zhì)進(jìn)行了表征，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。我們測(cè)定了酶的底物譜以及對(duì)不同底物的米氏常數(shù)(乙醇Km=22259M，L蘇氨酸Km11291aM)，并構(gòu)建和分析了突變體菌株的表型，證實(shí)此酶為L(zhǎng)蘇氨酸脫氫酶(L—ThreonineDehydrogenase，LTDH)，可能在蘇氨酸代謝中發(fā)揮作用。以L一蘇氨酸為底物進(jìn)行后續(xù)研究，結(jié)果表明，其最適溫度為39oC，最適pH為pH98，更傾向于利用NAD(而非NADP)作為催化氧化的輔

4、酶，等電點(diǎn)為pH54。此外，利用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP—AES)進(jìn)行金屬離子分析(Fe，Zn)，用圓二色譜法進(jìn)行了的二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析研究。2、以來(lái)自噬菌體OXl74的蛋向proteinA木(proA，proteinID：NP040704)為融合標(biāo)簽與脫氫酶形成融合蛋白，利用proteinA具有識(shí)別、切割并催化特定序列的ssDNA與自身酪氨酸殘基(Tyr)通過(guò)形成磷酸二酯鍵連接的特性建1訌了蛋白質(zhì)ssDNA高效交聯(lián)方法。反應(yīng)

5、在交聯(lián)緩沖液中進(jìn)行，交聯(lián)溫度為37oC，時(shí)間為10min，制得蛋白質(zhì)一ssDNA交聯(lián)物。3、通過(guò)建立的蛋白質(zhì)ssDNA交聯(lián)方法，實(shí)施了甘油脫氫酶和谷氨酸脫氫酶在溫和條件下與ssDNA的交聯(lián)反應(yīng)，完成蛋白質(zhì)一ssDNA交聯(lián)物的制備。堿基的互補(bǔ)配對(duì)使我們可以通過(guò)設(shè)計(jì)互補(bǔ)的ssDNA來(lái)指導(dǎo)脫氫酶一ssDNA交聯(lián)物的空間排布，實(shí)現(xiàn)脫氧酶復(fù)合體組裝，創(chuàng)建可編程的自組裝多酶協(xié)同催化體系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，融合proteinA木標(biāo)簽?zāi)軌蛱岣咴摎涿傅腖L