15800.東北野豬成纖維細胞冷應激應答分子機制研究

1、學校代碼：10225學號：B13130學位論文東北野豬成纖維細胞冷應激應答分子機制研究指導教師姓名：申請學位級別：論文提交日期：授予學位單位：李忠秋馬建章院士博士2813年10月東北林業(yè)大學東北林業(yè)大學學科專業(yè)：野生動植物保護與利用論文答辯日期：2013年12月授予學位日期：答辯委員會主席：論文評閱人：圣：『厶彤素大學摘要摘要野豬是“受國家保護的有益的或者有重要經(jīng)濟、科學研究價值的陸生野生動物之一”。東北野豬屬亞洲野豬東北亞種，主要分布

2、在大興安嶺、小興安嶺、張廣才嶺、老爺嶺、完達山、長白山，遼寧的東部橫仁、寬甸等地，該區(qū)域冬季漫長、寒冷，最低氣溫可達一404。C。相對于家豬而言，東北野豬具有抗逆性高、抗病性強、食性廣泛、對于自然界惡劣氣候尤其是寒冷環(huán)境具有極強的耐受能力。目前國內(nèi)外關于低溫環(huán)境對野生動物影響的研究鮮有報道，更多是集中在對模式生物以及畜禽上的研究。研究內(nèi)容大都集中于血液生化指標、激素和外周血液淋巴細胞熱休克蛋白70(heatshockprotein70，

3、HSP70)的表達變化等方面，而在細胞水平上進行相關分子機制的研究報道并不多。細胞分子水平的變化是機體各種生理反應的基礎，對細胞冷應激相關基因的研究有助于深入理解冷應激對機體影響的生物學機制。野豬是家豬的祖先，遺傳基礎與家豬相似，但未受到人工選擇，其現(xiàn)有性狀表型均是受自然選擇的結(jié)果，因此，以野豬為實驗材料，在細胞水平上研究低溫環(huán)境對其機體影響的分子機制將更接近真實、客觀的作用機理。本項目的研究結(jié)果將為今后更好的保護與利用野豬資源提供理論

4、幫助。本研究首先構(gòu)建東北野豬成纖維細胞培養(yǎng)體系，對細胞進行冷應激處理，對重要的冷應激蛋白冷誘導RNA結(jié)合蛋白進行克隆和分析，在此基礎上，應用流式細胞術、RTPCR和real—timePCR等實驗技術，進一步研究冷應激對細胞周期、細胞凋亡及冷應激相關基因表達的影響及作用機理。從細胞分子水平研究東北野豬的抗寒冷機制，為研究冷應激分子機制建立科學的細胞模型提供理論參考，為體外培養(yǎng)細胞作為試驗材料用于揭示機體冷應激分子機制提供了有力佐證，為利用

5、東北野豬在改良家豬抗寒冷應激分子育種提供理論支持。主要研究結(jié)果如下：1東北野豬成纖維細胞培養(yǎng)體系的建立及生物學特性研究(1)組織塊在貼壁時間為4h，胰酶消化3min，傳代細胞貼壁時間為6h條件下，經(jīng)2次傳代便可得到純化的成纖維細胞，成功建立簡單易行的東北野豬成纖維細胞培養(yǎng)體系。(2)建立的東北野豬成纖維細胞系活率高、細胞生長迅速、細胞形態(tài)良好、無微生物污染。2冷誘導RN^結(jié)合蛋白基因克隆與序列分析從32。C處理的東北野豬成纖維細胞中提取