NV-lipocalin2抗大腸癌的體外實驗研究.pdf

1、目的：構建攜帶Lipocalin2基因的條件增殖型溶瘤腺病毒NV-lipocalin2，并應用體外細胞學實驗方法研究NV-lipocalin2抗大腸癌的作用及其機制。
　　方法：利用RT-PCR技術獲取目的基因Lipocalin2并將其克隆至pCA13質粒,構建重組的質粒pCA13-lipocalin2。使用BglⅡ酶從pCA13-lipocalin2質粒中酶切出包含lipocalin2基因及CMV啟動子的表達框,把該表達框再亞克

2、隆入質粒pZD55,獲得重組質粒pZD55-lipocalin2。之后分別將pCA13-lipocalin2和pZD55-lipocalin2與pBHGE3共轉染到293細胞,經(jīng)過同源重組產生攜帶lipocalin2基因的靶向性溶瘤腺病毒（NV-lipocalin2）。并用PCR方法和wester-blot方法對新構建的病毒從基因和蛋白水平進行鑒定。把獲得的NV-lipocalin2病毒按不同濃度加入到大腸癌細胞SW480中，采用四甲基

3、偶氮哩鹽叮（MTT）法檢測其對腫瘤的增殖抑制效應，以及其分別與中藥姜黃素和化療藥物5-FU的協(xié)同抗腫瘤作用,采用Annexin V/PI染色流式檢測細胞凋亡,采用透射電鏡觀察腫瘤細胞的凋亡，最后采用wester-blot法,檢測凋亡相關基因Caspase-3，9的蛋白表達,以研究NV-lipocalin2誘導大腸癌細胞凋亡的機制。
　　結果：通過PCR鑒定病毒DNA序列顯示：NV-lipocalin2保留了E1A區(qū)缺失了E1B55

4、序列。借助lipocalin2的CDS區(qū)設計的引物能從構建的病毒中擴增出相應的目的基因條帶；同時采用wester-blot法可檢測到被腺病毒感染的SW480細胞強表達Lipocalin2蛋白。重組的靶向性增殖型腺病毒抗大腸癌SW480細胞的作用優(yōu)于單存的病毒載體（ZD55），其抗癌作用呈時間依賴性和濃度依賴性，其與中藥姜黃素和化療藥物5-FU都有很好的協(xié)同治療作用并呈濃度依賴性。NV-lipocalin2可通過活化Caspase-3,9