纖維素酶ChCe15A活性架構(gòu)中關(guān)鍵氨基酸的功能分析與其熒光淬滅動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、木質(zhì)纖維素是地球上分布最廣、蘊(yùn)藏量最豐富的可再生資源，實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素的高效轉(zhuǎn)化夠解決人類面臨的能源和資源問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)人類的可持續(xù)發(fā)展。在木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化過(guò)程中需要多種糖苷水解酶的協(xié)同作用，糖苷水解酶GH5家族被稱為“纖維素酶家族A”，在數(shù)量上是非常龐大的糖苷水解酶家族?；谛蛄幸恢滦?，GH5家族被分為51個(gè)亞家族。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)和結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)的發(fā)展，基于序列和結(jié)構(gòu)信息的活性架構(gòu)序列譜對(duì)纖維素酶進(jìn)行理性改造，有助于探究纖維素酶與底物之間的

2、結(jié)合、催化斷鍵和產(chǎn)物釋放機(jī)制，闡明其中的共性規(guī)律，為實(shí)現(xiàn)纖維素的高效轉(zhuǎn)化奠定堅(jiān)實(shí)的理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。本文以糖苷水解酶GH5-2亞家族的ChCel5A為研究對(duì)象，對(duì)其活性架構(gòu)中起關(guān)鍵作用的完全保守氨基酸和相對(duì)保守的芳香族氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變和理化性質(zhì)的分析，尋找纖維素酶降解底物時(shí)的規(guī)律。本文的研究?jī)?nèi)容及主要結(jié)果如下:
　　1、對(duì)GH5-2亞家族的纖維素酶進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，找到完全保守氨基酸的N165、Y227和相對(duì)保守芳香族氨基酸W

3、61、Y203。
　　對(duì)整個(gè)GH5-2亞家族有結(jié)構(gòu)的酶分子進(jìn)行了生理生化性質(zhì)的統(tǒng)計(jì)，顯示GH5-2亞家族的酶分子具有較寬的溫度和pH的適應(yīng)范圍。該家族的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為Tm桶，即（β/α）8桶結(jié)構(gòu)，活性架構(gòu)具有較強(qiáng)的負(fù)電性，嗜熱酶的帶電性基本強(qiáng)于中溫酶和低溫酶的帶電性。根據(jù)活性架構(gòu)序列譜以及ChCel5A與底物距離為5(A)的原則，找到完全保守氨基酸N165、Y227和相對(duì)保守芳香族氨基酸W61、Y203進(jìn)行研究，該項(xiàng)研究為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)工

4、作奠定了基礎(chǔ)。
　　2、對(duì)ChCel5A活性架構(gòu)中保守氨基酸進(jìn)行了突變和功能分析，發(fā)現(xiàn)保守氨基酸的突變能夠改變酶分子的最小結(jié)合糖單元。
　　通過(guò)糖苷水解酶GH5家族的活性架構(gòu)序列譜中的N165和Y227,都位于-1位亞位點(diǎn)，推測(cè)對(duì)于維持酶活力具有非常重要的作用，因此通過(guò)定點(diǎn)突變和大腸桿菌異源表達(dá)的方法進(jìn)行N165A和Y227A的功能分析。N165A和Y227A突變體的CMC酶活均降低90％以上，說(shuō)明完全保守氨基酸對(duì)于維持酶分

5、子的催化活性具有至關(guān)重要的作用。對(duì)N165A和Y227A降解RAC的產(chǎn)物譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，主要產(chǎn)物是纖維二糖、纖維三糖和纖維四糖，而野生型蛋白的主要產(chǎn)物中沒(méi)有纖維四糖，說(shuō)明N165A和Y227A突變體的最小結(jié)合糖單元不再是纖維四糖而是纖維五糖，說(shuō)明完全保守氨基酸的突變能夠改變酶分子的最小結(jié)合糖單元以及作用模式。
　　3、通過(guò)突變和功能分析發(fā)現(xiàn)，ChCel5A活性架構(gòu)中-2亞位點(diǎn)氨基酸對(duì)維持酶功能具有更加重要的作用

6、。
　　W61位于ChCel5A活性架構(gòu)-2亞位點(diǎn)，Y203位于+1亞位點(diǎn)，是其活性架構(gòu)中的相對(duì)不保守氨基酸。W61Y的CMC酶活降低降低了72％。W61Y的Km升高，kcat降低，說(shuō)明W61Y的突變使酶分子與底物間的結(jié)合力降低，產(chǎn)物釋放變慢。從結(jié)構(gòu)上分析，W61是ChCel5A活性架構(gòu)中5(A)范圍內(nèi)的氨基酸，將W61突變成Y后，其與-2位糖環(huán)中C6的距離為8.2(A)，其與底物失去了相互作用，最終影響了酶活;Y203W的CMC

7、酶活降低了68％，從結(jié)構(gòu)上分析，Y203與+1位的C3形成一個(gè)氫鍵，突變成W之后，W與底物不會(huì)形成氫鍵有利于產(chǎn)物釋放。Y203W的Km升高，kcat也升高，但kcat/Km降低，說(shuō)明kcat的升高不足以彌補(bǔ)Km的升高對(duì)酶活造成的影響，從而酶活降低。-2亞位點(diǎn)W61Y的酶活改變較+1亞位點(diǎn)的Y203W明顯，且產(chǎn)物譜中降解四糖的能力減弱，因此-2亞位點(diǎn)對(duì)于維持酶活力具有重要的作用。
　　4、利用熒光光譜法測(cè)定了ChCel5A活性架構(gòu)中

8、亞位點(diǎn)氨基酸與底物的結(jié)合力，同時(shí)發(fā)現(xiàn)pNP類物質(zhì)不適宣作為底物來(lái)表征纖維素酶的性質(zhì)。
　　酶分子中的色氨酸可以被295nm的激發(fā)光激發(fā)，當(dāng)酶分子與底物相互作用后導(dǎo)致熒光淬滅，根據(jù)Stern-Volmer方程計(jì)算出色氨酸與底物之間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合力。本文利用熒光光譜的方法測(cè)定了ChCel5A活性架構(gòu)中關(guān)鍵芳香族氨基酸(W61Y、W287A、Y203W)與三種底物(pNP、pNPC、CMC)的結(jié)合常數(shù)，分析了ChCel5A中單個(gè)芳香族