農(nóng)桿菌介導(dǎo)人源輪狀病毒抗原蛋白G1VP4和G2VP4基因遺傳轉(zhuǎn)化花生的研究.pdf

1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)人源輪狀病毒抗原蛋白GIVP4和G2VP4基因花生(Arachis hypoaea L.)是世界范圍內(nèi)的一種重要的油料經(jīng)濟(jì)作物,含有豐富的蛋白質(zhì)和其他營養(yǎng)物質(zhì),其蛋白質(zhì)含量可達(dá)25﹪.同時(shí)花生貯藏期長,生產(chǎn)規(guī)模不受限制,因此花生是生產(chǎn)口服基因工程疫苗的理想載體. 本研究所用農(nóng)桿菌菌株為LBA 4404.質(zhì)粒為雙價(jià)表達(dá)載體pBI121,含35SCaMV啟動子連接的人源輪狀病毒抗原蛋白VP4基因(2350bp)和新霉素磷酸

2、轉(zhuǎn)移酶NPTⅡ基因,即以卡那霉素(Kan)抗性基因作為抗性篩選基因.研究選用了花育23號和魯花14號2個花生栽培品種,以子葉為外植體建立和完善了子葉再生體系,研究發(fā)現(xiàn)在6-BA 5.00mg/L.、2,4-D 1.50mg/L的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基里,花育23號和魯花14號子葉外植體叢生芽誘導(dǎo)率均最高,分別達(dá)89.67﹪和83.33﹪,子葉再生體系是目前比較理想的花生轉(zhuǎn)化體系. 研究影響子葉再生體系轉(zhuǎn)化效率的因素表明,當(dāng)菌液OD<,60

3、0>為0.5-0.7、侵染時(shí)間10min、共培養(yǎng)時(shí)間3d、每50ml菌液添加煙草提取物1.0ml可獲得較好的轉(zhuǎn)化效果.對抗生素濃度對芽分化率的影響研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)頭孢霉素(Ce0250mg/L、羧芐青霉素(Carb)250-500mg/L時(shí),效果最好,不但可以完全抑制農(nóng)桿菌生長,而且有較高的芽誘導(dǎo)率. 本研究對抗Kan的植株進(jìn)行了PCR檢測、Southern雜交、RT-PCR分子生物學(xué)技術(shù)檢測,證實(shí)了人源輪狀病毒抗原蛋白G1VP4和

4、G2VP4基因已經(jīng)整合到了花生栽培品種魯花14號和花育23號的基因組DNA中. 選取26株表現(xiàn)Kan抗性的花生植株進(jìn)行.NPTⅡ基因的PCR.檢測,經(jīng)1﹪瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果有22株能擴(kuò)增出620bp左右的.NPTⅡ基因條帶,陽性率約為84.62﹪,提取NPTⅡ基因顯示為陽性的植株葉片DNA作模板,用VP4基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,所有NPTⅡ基因陽性的植株均擴(kuò)增出了約2350bp的特異性條帶,而野生型沒有,初步證明VP4

5、基因已整合到花生基因組中. 對部分轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)一步進(jìn)行PCR-Southern雜交和Southern雜交分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)基因植株中出現(xiàn)了陽性雜交信號,這表明VP4基因的確已經(jīng)整合到花生的基因組中,并且是單拷貝.用RT-PCR分析了11株轉(zhuǎn)G1VP4基因的植株,結(jié)果表明插入魯花14號中的VP4基因已經(jīng)正常轉(zhuǎn)錄. 以花生為生物反應(yīng)器開展口服疫苗研制是完全可行的,本研究利用花生基因工程表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)輪狀病毒口服疫苗的前期產(chǎn)物