油菜蜂花粉多糖的提取、分離、結(jié)構(gòu)及生物活性的研究.pdf

1、本文以油菜蜂花粉為原料，對(duì)油菜蜂花粉多糖的提取工藝、分離純化、結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行了研究，并采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)探明了油菜蜂花粉多糖的抗腫瘤作用及其作用機(jī)制。其主要研究結(jié)果如下： 1油菜蜂花粉多糖提取、分離、純化與結(jié)構(gòu)特性油菜蜂花粉經(jīng)沸水浸提、乙醇沉淀可得油菜蜂花粉多糖RPP。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)油菜蜂花粉多糖的提取工藝進(jìn)行研究，結(jié)果表明：溫度對(duì)多糖得率的影響最大，其次為提取時(shí)間、次數(shù)，料液比的影響最?。黄渥顑?yōu)提取條件為

2、：料液比1：4，90℃水浴條件下，浸提4次，每次浸提4h，提取率達(dá)1.45％。 RPP經(jīng)DEAE-SephadexA-25纖維素柱層析可得四種多糖RPP1、RPP2、RPP3、RPP4，得率分別為5.76％、2.82％、26.8％和13.4％；經(jīng)葡聚糖凝膠層析柱進(jìn)一步分離純化可知RPP1為均一多糖，RPP2、RPP3、RPP4為非均一多糖，RPP2-2、RPP3-2、RPP4-1分別為其主要組分。RPP1、RPP2-2、RPP3

3、-2、RPP4-1中性糖含量分別為：56.9％、37.5％、36.4％、4.20％，蛋白質(zhì)含量分別為：10.2％、5.65％、35.6％、31.0％；糖醛酸含量分別為：8.09％、7.25％、8.96％、1.35％。氣相色譜分析表明，RPP4-1為葡聚糖，RPP1、RPP2-2、RPP3-2由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖組成，RPP2-2還含有少量木糖，各級(jí)分的摩爾比分別為：1.00：2.05：0.57：4.05；1.00：0.50

4、：0.45：1.63：0.12；1.00：3.23：0.74：7.21。 GPC法測(cè)定RPP各級(jí)分的數(shù)均分子量分別為36137、37136、63904、57592；紫外光譜、紅外光譜、NMR圖譜分析推測(cè)RPP3-2為一種吡喃型糖蛋白復(fù)合物，分子中含α、β兩種糖苷鍵；堿性β-消除反應(yīng)說(shuō)明在RPP3-2中存在O-糖苷鍵，剛果紅試驗(yàn)說(shuō)明油菜蜂花粉多糖不具有三螺旋結(jié)構(gòu)。 2油菜蜂花粉多糖體內(nèi)抗腫瘤活性研究(1)RPP的抑瘤效果。

5、動(dòng)物抑制性腫瘤法試驗(yàn)結(jié)果表明RPP對(duì)S180腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，三個(gè)灌胃劑量50、100、200mg/(kg.d)的抑瘤率分別為26.89％、34.45％、51.26％，存在明顯量效關(guān)系，且高劑量組抑瘤率明顯高于常用抗癌藥Cy(46.22％)。 (2)RPP的免疫增強(qiáng)作用。RPP可顯著提高荷瘤鼠免疫器官重量，增強(qiáng)荷瘤鼠單核細(xì)胞吞噬能力、脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力及NK細(xì)胞的殺傷力，將荷瘤鼠DTH反應(yīng)程度、抗體水平恢復(fù)至正常水平，表

6、明RPP具有增強(qiáng)荷瘤鼠特異性和非特異1性免疫功能的作用。 (3)RPP對(duì)荷瘤鼠抗氧化能力的影響。小鼠接種S180腫瘤細(xì)胞后體內(nèi)抗氧化能力明顯下降，RPP能顯著提高荷瘤鼠體內(nèi)抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性，降低荷瘤鼠血清LDH活性，減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量，揭示RPP可增強(qiáng)荷瘤鼠機(jī)體抗氧化能力。 (4)RPP對(duì)環(huán)磷酰胺抗癌活性和毒性的影響。荷瘤鼠外周血象發(fā)生明顯異常，白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞明顯增多(P＜0.05，與NC

7、相比)，紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板數(shù)明顯降低(P＜0.01，與NC相比)，灌服RPP能使外周血得到明顯改善。RPP與環(huán)磷酰胺合用有一定協(xié)同作用，可使環(huán)磷酰胺抗癌活性由46.22％提高到57.55％(與高劑量RPP合用)，且對(duì)環(huán)磷酰胺的毒副性有一定拮抗作用，可明顯改善環(huán)磷酰胺對(duì)荷瘤鼠白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞的極顯著破壞作用，一定程度緩解環(huán)磷酰胺對(duì)荷瘤鼠胸腺、脾臟的萎縮。 (5)RPP對(duì)荷瘤鼠組織形態(tài)的影響。采用動(dòng)物抑制性腫瘤

8、法，以環(huán)磷酰胺為對(duì)照，觀察RPP對(duì)荷瘤鼠腫瘤、肝、腎、脾組織形態(tài)的影響，結(jié)果表明RPP對(duì)荷瘤鼠肝、腎、脾組織無(wú)明顯毒副作用，且有一定保護(hù)作用；組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果還表明，高劑量RPP抑瘤效果較環(huán)磷酰胺好，與環(huán)磷酰胺合用有一定協(xié)同作用，同時(shí)可緩解環(huán)磷酰胺對(duì)機(jī)體免疫器官的損害。 3RPP對(duì)荷瘤鼠脾細(xì)胞細(xì)胞因子分泌及其mRNA表達(dá)的影響雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)結(jié)果表明RPP可明顯促進(jìn)荷瘤鼠脾細(xì)胞TNF-α、IL-2的分泌，逆轉(zhuǎn)錄-聚合

9、酶鏈反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果表明RPP可提高顯著TNF-αmRNA、IL-2mRNA表達(dá)(P＜0.01，與荷瘤模型組比)，且在一定范圍內(nèi)存在較好的濃度依賴關(guān)系，說(shuō)明RPP可通過(guò)提高荷瘤鼠細(xì)胞因子mRNA表達(dá)來(lái)達(dá)到抗腫瘤目的。 4油菜蜂花粉多糖體外抗腫瘤活性研究MTT法檢測(cè)體外抑瘤試驗(yàn)結(jié)果表明RPP、RPP3-2對(duì)NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，兩者在所用濃度范圍內(nèi)均有明顯的劑量效應(yīng)、時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，RPP3-2的作用優(yōu)于RPP；RPP、RPP