結(jié)核分枝桿菌Rv0901基因功能研究.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種世界性傳染病。世界衛(wèi)生組織2004年的世界衛(wèi)生報(bào)告指出結(jié)核病已經(jīng)成為可治療的感染性疾病當(dāng)中的頭號(hào)致死性疾病。WHO感染性疾病的死亡登記和監(jiān)管記錄表明：2004年全球新增結(jié)核病人890萬，其中390萬例痰涂片陽性，而2004年全球結(jié)核病死亡人數(shù)則達(dá)到了170萬。隨著人口流動(dòng)增加、HIV與結(jié)核分枝桿菌伴發(fā)感染以及結(jié)核分枝桿菌多重耐藥性菌株的出現(xiàn)等原因，結(jié)核分枝桿菌的傳播呈逐年穩(wěn)步增長趨勢。近年來研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核

2、病與多種慢性疾病有密切相關(guān)，如糖尿病，營養(yǎng)不良和由吸煙及大氣污染導(dǎo)致的呼吸系統(tǒng)疾病等等。因此，探索結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)制和新的防治策略顯得十分重要。而結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組測序的完成和更新，為結(jié)核分枝桿菌基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的研究提供了重要而更加精確的資料。 初步研究表明，一組尚未確定生物學(xué)特征和功能的結(jié)核分枝桿菌假想蛋白基因，可能與其毒力致病機(jī)制有關(guān)。這些蛋白基因皆位于細(xì)胞壁和細(xì)胞活動(dòng)基因及其調(diào)節(jié)蛋白編碼基因的下游，受同一

3、操縱子控制，其編碼產(chǎn)物是構(gòu)成結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的重要構(gòu)件，其中尤以Rv0901基因最為引人注目。該基因在1998年基因組測序完成時(shí)被劃分為編碼未知蛋白類及保守的假想蛋白類基因，于2002年基因組更新時(shí)被重新劃入了細(xì)胞壁和細(xì)胞突(cell-wall and cell processes category)類基因。結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的特殊結(jié)構(gòu)和成分在其與宿主細(xì)胞的相互作用及其致病中發(fā)揮著重要的作用。為研究Rv0901基因的功能及其與結(jié)核分枝

4、桿菌毒力、致病機(jī)制的關(guān)系，我們首先將該基因528bp片段從基因組中擴(kuò)增出，在原核融合表達(dá)載體pET32a (+) 中成功表達(dá)了pET-Rv090l融合蛋白并制備了蛋白的多克隆抗體，為研究該基因功能奠定了基礎(chǔ)。繼而將Rv0901基因片段構(gòu)建進(jìn)入真核表達(dá)載體PcDNA3．1，在真核細(xì)胞中得以成功表達(dá)，再將該基因片段轉(zhuǎn)入小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，研究該基因?qū)π∈蟾骨痪奘杉?xì)胞活性的影響。進(jìn)一步通過穿梭表達(dá)載體pMV261經(jīng)電轉(zhuǎn)化將Rv0901基因片段重

5、組入不含該基因序列的無毒恥垢分枝桿菌(mc<'2>155)，并在重組恥垢分枝桿菌(Rmc<'2>155)中成功表達(dá)了19kDa的Rv0901編碼蛋白。將經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的重組恥垢分枝桿菌和未重組的恥垢分枝桿菌同時(shí)以相同復(fù)數(shù)感染人單核巨噬細(xì)胞THP-1 和BALB/c 小鼠，比較重組株和未重組株的細(xì)胞學(xué)和動(dòng)物學(xué)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Rv0901 基因片段轉(zhuǎn)入小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的凋亡增加，其培養(yǎng)液上清中的N0 (一氧化氮)和IFN-γ

6、(γ干擾素)釋放量增加。．Rmc<'2>155誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞的凋亡率高于mc<'2>155，其感染THP-1 細(xì)胞后細(xì)胞的存活率低于mc<'2>155的感染，且細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的產(chǎn)生高于mc<'2>155的感染。Rmc<'2>155感染BALB/c小鼠后小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平高于mc<'2>155的感染，小鼠血清中IFN-γ和NO的釋放量均增加，但是較mc<'2>155沒有顯著差異。以上結(jié)果提示Rv0901可能對(duì)于結(jié)核分枝桿菌在宿主