黑色素瘤相關(guān)抗原-A3在肺癌中的表達(dá)及臨床意義的研究.pdf

1、肺癌是全世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，也是全球癌癥死亡的首要原因，嚴(yán)重威脅人類健康。在美國，肺癌在男性和女性的惡性腫瘤中的病死率均居第一位。2009年約有219440例肺癌新發(fā)病例，并有159390例肺癌患者死亡。在發(fā)展中國家，特別是中國，肺癌的發(fā)生率一直呈上升趨勢。如果不積極控制吸煙和空氣污染，到2025年我國每年肺癌患者將超過100萬，成為世界第一肺癌大國。非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCL

2、C)占全部肺癌約85％。盡管診斷方法及治療手段的不斷更新，NSCLC的治療在過去的幾十年并未取得突破性的進(jìn)展，即使Ⅰ期的NSCLC患者，其5年生存率也只有50％，Ⅱ期患者，5年生存率只有30％，晚期患者，5年生存率仍然不到15％，腫瘤侵襲以及轉(zhuǎn)移是肺癌患者死亡的主要原因。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)志物在NSCLC的輔助診斷、判斷預(yù)后以及評估療效中發(fā)揮著日益重要的作用。因此，大量的實(shí)驗(yàn)研究都在尋求敏感性和特異性都較高的分子標(biāo)記物，可

3、以早期診斷肺癌，評估療效和判斷預(yù)后。黑色素瘤相關(guān)抗原E-A3(melanoma-associated antigen-A3，MAGE-A3)是一種腫瘤-睪丸抗原，首先發(fā)現(xiàn)于黑素瘤細(xì)胞。它作為人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并鑒定的腫瘤特異性抗原，廣泛表達(dá)于人體的多種腫瘤組織及細(xì)胞，如黑色素瘤、頭頸部鱗癌、肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等，而在正常組織中（除睪丸和胎盤外）不表達(dá)。有研究顯示，30％～50％的NSCLC患者表達(dá)MAGE-A3，表明MAGE-A3在人類

4、腫瘤形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的病理過程中可能起著非常重要的作用。
　　 研究目的:
　　 1.研究MAGE-A3在肺癌患者外周血中的表達(dá)規(guī)律，并分析其與肺癌臨床病理特征的關(guān)系，初步探討MAGE-A3在肺癌中的輔助診斷價(jià)值。
　　 2.判斷MAGE-A3在肺癌療效評估和預(yù)后判斷中的價(jià)值。
　　 3.構(gòu)建重組慢病毒載體PLV-MAGE-A3-GFP，并檢測其在人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的表達(dá)情況。
　　 材料與方法

5、:
　　 1.研究對象（分為兩部分）
　　 第一部分:肺癌患者，分三組；
　　 第二部分:非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549。
　　 肺癌組:共120例，選自2009年6月到2011年9月于南京軍區(qū)南京總醫(yī)院住院的患者，均為肺癌患者，未經(jīng)治療并計(jì)劃接受至少1周期標(biāo)準(zhǔn)一線含鉑的兩藥聯(lián)合的化療。入組的標(biāo)準(zhǔn):
　　 (1)經(jīng)細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)證實(shí)為肺癌;
　　 (2)按照2009年國際肺癌研究協(xié)學(xué)會(Int

6、ernational Association for the Study of Lung Cancer，IASLC)公布修訂的UICC7th分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，Ⅰ-Ⅳ期NSCLC患者以及小細(xì)胞肺癌患者;
　　 (3)按ECOG PS評分為0-2分;
　　 (4)肝腎功能及血常規(guī)無明顯異常，無其他并發(fā)病或并存病。
　　 肺良性病變組:共39例，為同期連續(xù)選取南京軍區(qū)南京總醫(yī)院住院患者。所有病例均經(jīng)臨床、影像學(xué)或病理學(xué)

7、診斷為肺良性病變，其中肺炎25例，肺結(jié)核1例，發(fā)熱菌血癥1例，肺不張2例，間質(zhì)性肺炎1例，慢性阻塞性肺疾病6例，支氣管擴(kuò)張伴感染3例。
　　 正常對照組:共32例，來自于南京軍區(qū)南京總醫(yī)院健康體檢者，均無心、肝、肺和腎等重要器官疾病，肝腎功能，血常規(guī)以及其他輔助檢查均無明顯異常者。
　　 2.實(shí)驗(yàn)方法
　　 (1)外周血標(biāo)本的采集:抽取健康志愿者及肺良性病變患者空腹外周靜脈血5ml，肺癌患者在第1及第3個(gè)周期化療

8、前分別抽取空腹外周靜脈血5ml。所有血樣抽取后30min內(nèi)進(jìn)行離心(室溫，2000RPM，10min)，吸出上清，留取下層血細(xì)胞沉淀，儲存于-80℃深低溫冰箱備用。
　　 采用TRIzol法提取外周血標(biāo)本的總RNA，用酶標(biāo)儀檢測所提取總RNA濃度及質(zhì)量，檢測合格者采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription PCR，RT-PCR)方法反轉(zhuǎn)錄成cDNA，試劑盒均購自Formentas Life Scienc

9、es公司（美國）。采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time PCR)方法的熒光染料法(SYBRGreen)檢測外周血中MAGE-A3的表達(dá)水平，選用Takara公司提供的SYBR Green試劑，上述實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒的使用說明書進(jìn)行操作。
　　 (2)利用DNA重組技術(shù)將黑色素瘤相關(guān)抗原-A3(MAGE-A3)基因克隆到帶GFP的慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒PLV中，經(jīng)限制性酶切和測序鑒定真核重組載體。將重組慢病毒載體PLV-MAGE

10、-A3-GFP與包裝質(zhì)粒pCMV-dR8.91及pCMV-VSV-G共轉(zhuǎn)染人胚腎上皮細(xì)胞株293TAB，包裝重組慢病毒LV-MAGE-A3-GFP，并感染人肺癌細(xì)胞株A549，觀察綠色熒光狀態(tài)，并采用Westernblot法檢測MAGE-A3蛋白的表達(dá)情況。
　　 3.客觀療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
　　 所有肺癌患者于第1及3周期化療前行全身檢查，按照RECIST1.1實(shí)體瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，化療療效評估分為:完全緩解(complete

11、 response，CR)、部分緩解(partial response，PR)、病灶穩(wěn)定(stable disease，SD)和病灶進(jìn)展(progressive disease，PD)。CR:所有靶病灶消失;所有病理性淋巴結(jié)短徑＜10mm;且腫瘤標(biāo)志物降至正常;PR:評價(jià)5個(gè)靶病灶（每個(gè)器官≦2個(gè)病灶），以最初的靶病灶直徑總和作為參照，其長徑總和縮小至少30％; PD:以化療過程中靶病灶直徑的總和最小值為參照，靶病灶長徑總和增加20％以

12、上，并且其絕對值增加超過5mm。除此之外，出現(xiàn)新病變也視為PD; SD:靶病灶長徑總和有縮小但未達(dá)PR或有增加但未達(dá)PD。CR和PR定義為有效，SD和PD定義為無效。
　　 4.隨訪
　　 以總生存期(Overall survival，OS)作為隨訪終點(diǎn)，OS定義為是指從隨機(jī)化開始至因任何原因引起死亡的時(shí)間。7例患者失訪。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料描述采用

13、例數(shù)、中位數(shù)、四分位間距。組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。治療前后組間比較采用Wilcoxon符號秩檢驗(yàn)。定性資料描述采用例數(shù)和百分比(％)。組間比較采用Chi-square檢驗(yàn)。等級資料采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。MAGE-A3區(qū)分疾病良惡性的性能分析采用ROC曲線法，計(jì)算曲線下面積及其95％可信區(qū)間。采用Kaplan-Meier法描述MAGE-A3不同基線水平時(shí)肺癌患者的生存情況，兩組生存情況的比較用

14、log-rank檢驗(yàn)。采用Cox回歸模型分析肺癌患者生存時(shí)間的影響因素，計(jì)算相關(guān)因素的危險(xiǎn)比(hazards rate，HR)。P≤0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.肺癌組、肺良性病變組、正常對照組患者的外周血MAGE-A3基因的表達(dá)量中位值分別為0.156，0.010，0.001。肺癌患者外周血MAGE-A3的表達(dá)水平高于肺良性病變組和正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。肺良性病變患者

15、的外周血MAGE-A3的表達(dá)水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　 2.通過建立ROC曲線確定外周血基線MAGE-A3基因水平區(qū)分良惡性的最佳截取值(cut-off)。MAGE-A3的曲線下面積(area under the ROC curve，AUC)為0.860(95％CI:0.809-0.911)。Cut-off值為0.115時(shí)敏感度(53.3％)和特異度(100％)最高。
　　 3.將12

16、0例肺癌組內(nèi)的研究對象按性別、年齡（＜60歲和≥60歲）、分期、分化程度（中高分化和低分化）、病理類型（腺癌、鱗癌和小細(xì)胞癌）、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、原發(fā)病灶部位（左肺和右肺）、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、有無吸煙史分成兩組，然后進(jìn)行比較，外周血MAGE-A3的表達(dá)水平在年齡、組織學(xué)類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及原發(fā)病灶部位等方面無明顯差異。伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者外周血中的MAGE-A3的中位表達(dá)水平高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者(0.407，0.024)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

17、義(P＜0.001)。Ⅲ-Ⅳ期NSCLC患者M(jìn)AGE-A3的中位表達(dá)水平(0.238，0.003)高于Ⅰ-Ⅱ期的NSCLC患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)。表明MAGE-A3在肺癌的表達(dá)可能與細(xì)胞增殖及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。此外，既往有吸煙史的肺癌患者M(jìn)AGE-A3的中位表達(dá)水平低于無吸煙史的肺癌患者(0.062，0.528)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。男性肺癌患者M(jìn)AGE-A3的中位表達(dá)水平低于女性肺癌患者(0.062，0.

18、559;P＜0.001)。
　　 4.120例肺癌患者中，收集了61例患者第1周期和第3周期化療前的外周血，動(dòng)態(tài)觀察治療的過程中MAGE-A3水平的變化情況?；熀?，外周血MAGE-A3水平較化療前顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。繪制ROC曲線，確定MAGE-A3下降率的最佳cut-off值，從而通過化療前后MAGE-A3的變化情況來預(yù)測化療療效。根據(jù)ROC曲線分析，AUC為0.700(95％CI:0.551-0.

19、850)，MAGE-A3下降率預(yù)測化療療效的最佳截取值為92.9％，此時(shí)敏感度和特異度都達(dá)到最高，分別是45.5％，97.4％，化療后MAGE-A3下降率≥92.9％定義為MAGE-A3應(yīng)答。MAGE-A3應(yīng)答與無MAGE-A3應(yīng)答的患者化療療效之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。
　　 5.120例肺癌患者，整體OS中位時(shí)間為10.630個(gè)月。繪制生存曲線，外周血MAGE-A3低表達(dá)的患者(MAGE-A3＜0.115)OS時(shí)

20、間（中位OS時(shí)間為20.930個(gè)月）長于高表達(dá)的患者( MAGE-A3≥0.115)（中位OS時(shí)間為6.500個(gè)月），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　 6.通過雙酶切重組MAGE-A3和PLV-GFP慢病毒質(zhì)粒載體可以構(gòu)建出重組真核慢病毒表達(dá)質(zhì)粒PLV-MAGE-A3-GFP。通過觀察綠色熒光狀態(tài)，并采用Western blot法檢測MAGE-A3蛋白的表達(dá)情況，證實(shí)重組慢病毒載體質(zhì)粒PLV-MAGE-A3-GFP與包

21、裝質(zhì)粒pCMV-dR8.91及pCMV-VSV-G包裝的重組慢病毒LV-MAGE-A3-GFP，可成功感染人肺癌細(xì)胞株A549。
　　 結(jié)論:
　　 1.MAGE-A3在肺癌患者外周血中的表達(dá)水平較肺部良性疾病組和健康對照組高，這表明MAGE-A3的異常表達(dá)與肺癌的發(fā)生有關(guān)。
　　 2.MAGE-A3在肺癌患者外周血中的異常表達(dá)與腫瘤的分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明MAGE-A3在肺癌的增殖以及侵襲性中可能起著非常重要

22、的作用。
　　 3.外周血中MAGE-A3的表達(dá)水平對肺癌的診斷有一定的輔助價(jià)值。
　　 4.MAGE-A3可以作為監(jiān)測肺癌患者化療療效、判斷預(yù)后的指標(biāo)。
　　 5.通過DNA重組技術(shù)重組MAGE-A3和PLV-GFP慢病毒質(zhì)粒載體可以構(gòu)建出重組真核慢病毒表達(dá)質(zhì)粒PLV-MAGE-A3-GFP。并通過與包裝重組慢病毒成功感染人肺癌細(xì)胞株A549。
　　 總結(jié):
　　 本實(shí)驗(yàn)采用Real time

23、PCR技術(shù)檢測肺癌患者、肺良性病變及正常對照者的外周血中MAGE-A3的表達(dá)水平，研究MAGE-A3的表達(dá)與肺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，探討MAGE-A3在肺癌中的診斷、療效評價(jià)以及判斷預(yù)后中的價(jià)值。此外，利用DNA重組技術(shù)將MAGE-A3基因克隆到帶GFP的慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒PLV中，體外構(gòu)建重組慢病毒載體PLV-MAGE-A3-GFP，成功感染人肺癌細(xì)胞株A549，并使MAGE-A3基因得以穩(wěn)定表達(dá)，為進(jìn)一步對非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)進(jìn)