轉(zhuǎn)錄輔助因子PC4在非小細胞肺癌中的表達及其功能的實驗研究.pdf

1、肺癌的死亡率在全球惡性腫瘤中居首位，成為惡性疾病中人類健康的頭號殺手，其中非小細胞肺癌(NSCLC)約占85％。大多數(shù)NSCLC臨床確診時已經(jīng)處于復發(fā)或轉(zhuǎn)移的晚期階段。作為標準一線治療的含鉑兩藥聯(lián)合化療方案進入一個平臺期，5年生存率只有10～15％。分子靶向治療為晚期NSCLC患者帶來了希望，分子靶標的探索也成為近年來國內(nèi)外研究惡性腫瘤治療的熱點。轉(zhuǎn)錄輔助因子PC4是一種進化過程中高度保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，廣泛存在于酵母、哺乳動物和人類細

2、胞中。人類PC4是一個127aa組成的單鏈DNA結(jié)合蛋白，在基因表達轉(zhuǎn)錄、復制、DNA損傷修復、染色體形成等過程中均能發(fā)揮調(diào)控作用。已報道的PC4功能研究主要集中在DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面，該基因更多新的生物學功能還有待進一步研究，尤其是PC4在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚未完全闡明。
　　 本課題以NSCLC為研究對象，重點研究轉(zhuǎn)錄輔助因子PC4在NSCLC中的表達及其功能。通過RT-PCR、Western blot和免疫組化技術(shù)檢測

3、PC4在NSCLC臨床樣本中的表達特點，探討其在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用和意義；進一步通過Western blot篩選高表達PC4的NSCLC細胞株建立體外研究模型，采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)PC4表達，檢測NSCLC細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡及細胞代謝的變化特點，揭示其在NSCLC細胞中的功能及其作用機制；進而建立NSCLC細胞裸鼠移植瘤模型，采用PC4特異性siRNA混合脂質(zhì)體瘤內(nèi)注射，明確其對NSCLC細胞移植瘤生長的調(diào)控作用。此

4、外，初步研究PC4在大鼠骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(MSCs)體外衰老過程中表達的變化特點，探討其在MSCs增殖和衰老中的調(diào)控作用。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.對6例手術(shù)切除的NSCLC樣品，通過RT-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，PC4在NSCLC癌組織中的表達水平高于NSCLC癌旁組織。進一步收集104例NSCLC癌組織及癌旁組織的臨床標本，通過免疫組化檢測證實PC4在NSCLC癌組織中表達上調(diào)，且

5、表達水平與NSCLC惡性程度及轉(zhuǎn)移情況具有相關(guān)性，惡性程度越高的NSCLC中PC4的表達水平越高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移情況下NSCLC中PC4的表達水平高于無轉(zhuǎn)移情況下NSCLC。
　　 2.對7種不同組織學類型的肺癌相關(guān)細胞株，通過Western blot篩選PC4高表達NSCLC細胞株，并建立A549、H460、H358三種細胞的體外研究模型。進一步通過RNAi下調(diào)PC4表達后發(fā)現(xiàn)，三種細胞增殖均受到抑制，細胞周期G1期阻

6、滯，S期減少，同時發(fā)生不同程度的凋亡，以A549細胞凋亡效應(yīng)最明顯，流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)A549細胞線粒體膜電位、細胞內(nèi)活性氧濃度、細胞內(nèi)ATP濃度均明顯降低，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)PCNA、Cyclin D1表達下調(diào)，p21表達上調(diào)，casepase-3表達被激活，PARP表達被剪切。
　　 3.建立A549細胞裸鼠移植瘤模型，采用PC4特異性siRNA混合脂質(zhì)體治療后發(fā)現(xiàn)，腫瘤生長受到抑制，腫瘤平均重量明顯降低，鏡下

7、可見明顯的腫瘤細胞壞死區(qū)，血管形成減少，Ki67表達降低，凋亡細胞增加，裸鼠平均體質(zhì)量及主要臟器組織的鏡下形態(tài)未發(fā)生明顯的變化。
　　 4.大鼠骨髓來源的MSCs長期體外連續(xù)傳代后出現(xiàn)細胞衰老，PC4在衰老細胞中表達降低。通過RNAi下調(diào)PC4表達后發(fā)現(xiàn)，MSCs增殖受到抑制，β-半乳糖苷酶染色陽性率增加。
　　 取得的主要結(jié)論包括：
　　 1.PC4在NSCLC中呈過表達狀態(tài)，可能在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移

8、中發(fā)揮作用，為NSCLC分子病理診斷提供了潛在的候選分子標志。
　　 2.下調(diào)PC4表達可抑制NSCLC細胞增殖，并誘導NSCLC細胞周期阻滯、細胞凋亡及細胞代謝水平降低，表明PC4在NSCLC細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡及細胞代謝的調(diào)控中發(fā)揮作用。
　　 3.PC4特異性siRNA混合脂質(zhì)體治療可抑制NSCLC細胞裸鼠移植瘤生長，且無明顯的毒副作用。體外和體內(nèi)研究表明，PC4可能是NSCLC分子靶向治療的新的潛在靶點。