E3連接示功圖TRIP通過降解TBK1負(fù)向調(diào)控IFn-β的產(chǎn)生和抗病毒免疫反應(yīng).pdf

1、天然免疫是宿主抵抗病毒感染的第一道防線，也是激活適應(yīng)性免疫的基礎(chǔ)，在宿主清除病毒的免疫反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用，因此成為當(dāng)前免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。天然免疫應(yīng)答就是病原微生物感染機(jī)體后，首先通過模式識別受體（pattern-recognition receptor,PRR）識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)，從而激活一系列信號通路，誘導(dǎo)包括IRF3和NF-κB在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子

2、的活化入核，協(xié)同促進(jìn)Ⅰ型干擾素、炎癥因子等多種細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌。Ⅰ型干擾素通過與細(xì)胞膜上的干擾素受體相互作用，誘導(dǎo)一系列抗病毒蛋白的表達(dá)，這些抗病毒蛋白協(xié)同作用，通過抑制病毒復(fù)制或誘導(dǎo)被感染細(xì)胞的凋亡，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)。炎癥因子所引發(fā)的炎癥反應(yīng)能夠激活天然免疫細(xì)胞，并誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動。由此可見，Ⅰ型干擾素等細(xì)胞因子對機(jī)體的抗病毒免疫反應(yīng)具有至關(guān)重要的作用。而在眾多信號通路中以Toll樣受體(Toll-like recep

3、tors，TLRs)和維甲酸誘導(dǎo)的基因Ⅰ樣受體(Retinoic acid-induced gene(Ⅰ)like receptors，RLRs)所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最為熱點(diǎn)。
　　 E3泛素連接酶(E3 ubiquitin ligase)是一種具有調(diào)節(jié)目的蛋白泛素化水平的分子，通常以K48偶聯(lián)的泛素化方式促進(jìn)目的蛋白通過蛋白酶體系統(tǒng)降解，或者通過K63偶聯(lián)的泛素化促進(jìn)目的蛋白的活化。目前已有報(bào)道顯示E3可以通過調(diào)節(jié)TLR和RL

4、R通路中的多個(gè)信號分子的降解或者活化從而調(diào)節(jié)并平衡免疫應(yīng)答。如TRIM30a、TRIM21、Triad3A、A20、RNF5、RNF125、AIP4以及PSMA等可通過K48泛素化形式降解相應(yīng)接頭蛋白，進(jìn)而負(fù)向調(diào)節(jié)信號通路。關(guān)于E3連接酶如何參與到抗病毒的信號通路中已成為當(dāng)今科學(xué)研究領(lǐng)域中的重要話題。
　　 一.研究目的:
　　 前期研究發(fā)現(xiàn)TRIP(TRAF-interacting Protein)在TNF-α介導(dǎo)的N

5、F-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用，并認(rèn)為TRIP通過阻斷TNFR與TRAF2的結(jié)合的方式負(fù)向調(diào)節(jié)信號通路;又有報(bào)道稱TRIP具有體外泛素化功能，但關(guān)于其靶點(diǎn)卻沒有相關(guān)報(bào)道。因此TRIP是否參與到TLR和RLR所介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生過程中，并且是否通過其泛素化功能起到相應(yīng)作用都不得而知。
　　 二.研究方法:
　　 1.TLR信號通路對TRIP的調(diào)控
　　 1.1、TLR對TRIP的表達(dá)影響
　　

6、 用TLR4的配體LPS刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，在刺激的不同時(shí)間點(diǎn)收獲RNA和蛋白，利用RT-PCR及Western Blotting方法，檢測LPS刺激后TRIP在RNA水平和蛋白水平上的變化。
　　 1.2、TRIP在細(xì)胞內(nèi)的定位
　　 將TRIP構(gòu)建到含F(xiàn)LAG標(biāo)簽和GFP標(biāo)簽的表達(dá)載體上，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293，利用免疫熒光技術(shù)檢測TRIP在細(xì)胞內(nèi)的定位。
　　 1.3、TLR對TRIP細(xì)胞內(nèi)定位的

7、影響
　　 用TLR4的配體LPS刺激巨噬細(xì)胞系RAW264.7，在不同時(shí)間點(diǎn)收獲細(xì)胞。將細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白分別提取，利用Western Blotting方法，檢測LPS刺激后TRIP在細(xì)胞內(nèi)的定位是否發(fā)生變化。
　　 2.TRIP負(fù)向調(diào)控TLR及RLR介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生
　　 2.1、TRIP對TLR3/4介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生的的影響
　　 用轉(zhuǎn)染小干擾RNA的方法將小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞的TRI

8、P進(jìn)行干擾，或者將TRIP超表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293-TLR3細(xì)胞系，用TLR3的配體Poly(I:C)和TLR4的配體LPS分別刺激細(xì)胞，利用RT-PCR，ELISA及報(bào)告基因方法檢測IFN-β的mRNA水平，分泌水平及報(bào)告基因活性水平的變化，探討TRIP對TLR介導(dǎo)的信號信號通路的影響。
　　 2.2、TRIP對RIG-Ⅰ介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生的的影響
　　 用轉(zhuǎn)染小干擾RNA的方法將小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞的TRIP進(jìn)行

9、干擾，或者TRIP超表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系，用Sev感染細(xì)胞系或者Poly(I:C)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，活化RIG-Ⅰ信號通路，分別用RT-PCR，ELISA和報(bào)告基因方法檢測IFN-β的mRNA水平，分泌水平及報(bào)告基因活性水平的變化，探討TRIP對RLR介導(dǎo)的信號信號通路的影響。
　　 3.TRIP調(diào)控IFN-β表達(dá)的分子機(jī)制
　　 3.1、TRIP對轉(zhuǎn)錄因子IRF3活性的影響
　　 將TRIP超表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H

10、EK293細(xì)胞系，再用Sev感染細(xì)胞系或者poly(I:C)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，檢測IRF3的磷酸化，二聚化以及報(bào)告基因活性的變化，探討TRIP過表達(dá)后對RLR介導(dǎo)的IRF3活化的影響。
　　 用轉(zhuǎn)染小干擾RNA的方法將小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞的TRIP進(jìn)行干擾，用TLR3的配體Poly(I:C)和TLR4的配體LPS分別刺激，利用Western Blotting方法，檢測TRIP干擾后對LPS及Poly(I:C)介導(dǎo)的IRF3活化的影響。

11、
　　 3.2、TRIP靶點(diǎn)的尋找
　　 將TLR，RLR信號通路中的TRIF,RIG-Ⅰ，MDA5，MAVS，TBK1,IRF3等接頭蛋白表達(dá)載體與TRIP過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293，利用RT-PCR及報(bào)告基因技術(shù)檢測TRIP對不同接頭蛋白所介導(dǎo)的IFN-βmRNA表達(dá)及報(bào)告基因活性的影響。
　　 3.3、TRIP對接頭蛋白的降解
　　 篩選高表達(dá)TRIP的RAW264.7穩(wěn)定細(xì)胞株或者用干擾RNA將

12、小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞的TRIP進(jìn)行干擾，用LPS刺激細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)，收獲蛋白，用TRAF3，TRAF6，IRF3，STAT1等特異性抗體做WesternBlotting，探究TRIP對各個(gè)接頭蛋白內(nèi)源性表達(dá)量的影響。
　　 將TLR，RLR信號通路中TRAF3，TBK1，IRF3等接頭蛋白的表達(dá)載體與TRIP的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293，Western Blotting的方法探究TRIP對各個(gè)接頭蛋白的表達(dá)量影響，并加入蛋白酶體

13、抑制劑MG132，觀察TRIP的降解作用是否消失。
　　 3.4、TRIP對接頭蛋白的泛素化
　　 將TRIP表達(dá)載體，接頭蛋白表達(dá)載體與泛素表達(dá)載體一同轉(zhuǎn)染HEK293，加入蛋白酶體抑制劑MG132，用接頭蛋白抗體做免疫共沉淀，用泛素抗體進(jìn)行Western Blotting，探討TRIP是否對接頭蛋白進(jìn)行泛素化。
　　 將TRIP表達(dá)載體，接頭蛋白表達(dá)載體與野生型泛素表達(dá)載體，K48位點(diǎn)突變泛素表達(dá)載體，K63

14、位點(diǎn)突變泛素表達(dá)載體一同轉(zhuǎn)染HEK293，用接頭蛋白對應(yīng)抗體做免疫共沉淀，用泛素標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western Blotting，探討TRIP對接頭蛋白的泛素化形式。
　　 4.TRIP抵抗病毒的生理意義
　　 4.1、TRIP對病毒介導(dǎo)的IFN-β的影響
　　 將TRIP超表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系，用Sev感染細(xì)胞，使用RT-PCR，ELISA技術(shù)檢測TRIP對IFN-β產(chǎn)生的影響;報(bào)告基因檢測TRIP對IF

15、N-β，IRF3活性的影響;WesternBlotting檢測TRIP對IRF3二聚化的影響，及對接頭蛋白降解的影響。
　　 用轉(zhuǎn)染小干擾RNA的方法將小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞的TRIP進(jìn)行干擾，用Sev感染細(xì)胞，重復(fù)上面的實(shí)驗(yàn)，探究干擾TRIP后是否具有相反的作用
　　 4.2、TRIP對病毒增殖復(fù)制影響
　　 將TRIP超表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系，24小時(shí)后轉(zhuǎn)染Poly(I:C)，靜置培養(yǎng)6小時(shí)并加入VSV

16、，第二天收集上清及細(xì)胞mRNA，利用病毒空斑實(shí)驗(yàn)及RT-PCR技術(shù)，檢測病毒的數(shù)量。
　　 用轉(zhuǎn)染小干擾RNA的方法將小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞的TRIP進(jìn)行干擾，重復(fù)上面的實(shí)驗(yàn)，探究干擾TRIP后是否具有相反的作用。
　　 三.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1.TLR信號通路對TRIP的調(diào)控
　　 1.1、TLR促進(jìn)TRIP的表達(dá)
　　 我們?yōu)榱颂接慣RIP是否參與TLR信號通路中，首先用TLR4的配體LPS刺激小

17、鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，通過RT-PCR及Western Blotting方法檢測發(fā)現(xiàn)，從LPS刺激4小時(shí)開始，TRIP的表達(dá)量逐漸增加，在12到16小時(shí)時(shí)達(dá)到高峰，LPS刺激24小時(shí)后TRIP的水平又有所恢復(fù)，用TLR3的配體Poly(I:C)刺激或者RIG-Ⅰ的配體Sev感染細(xì)胞后，TRIP的表達(dá)量也發(fā)生同樣的變化。這說明TRIP有可能參與到TLR及RLR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中。
　　 1.2、TRIP主要定位于細(xì)胞漿
　　

18、由于很多文獻(xiàn)報(bào)道的TRIP的定位差距較大，有人認(rèn)為TRIP分布在胞核，有人認(rèn)為TRIP在胞質(zhì)，TRIP的定位對于其之后的功能研究而言至關(guān)重要，因此我們通過免疫熒光的方法檢測TRIP的細(xì)胞定位，用FLAG-TRIP轉(zhuǎn)染HEK293，24小時(shí)后，進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，用抗FLAG的熒光二抗孵育細(xì)胞，在488nm波長激發(fā)光下觀察，發(fā)現(xiàn)TRIP即分布在胞核又分布在胞漿，且在胞漿的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在胞核中的量，另外我們觀察到一個(gè)有趣的現(xiàn)象，即TRIP在胞漿

19、中成散點(diǎn)狀分布，這與TBK1的分布極其相似，這也為之后的靶點(diǎn)尋找提供了一個(gè)依據(jù)。另外我們構(gòu)建了GFP標(biāo)簽的TRIP表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞系中，直接用熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)相同現(xiàn)象。
　　 1.3、TLR不影響TRIP在細(xì)胞內(nèi)定位
　　 將RAW264.7鋪小平皿，靜置培養(yǎng)16-24h，LPS或Poly(i:c)刺激30min，60min，提取細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白，調(diào)節(jié)濃度后進(jìn)行Western Blottin

20、g，結(jié)果顯示LPS或Poly(I:C)刺激細(xì)胞后，RAW264.7細(xì)胞中TRIP并沒有出現(xiàn)出核或入核情況。由于TRIP主要位于細(xì)胞漿中，且刺激后沒有發(fā)生明顯入核，說明TRIP可能主要作用于胞漿蛋白。
　　 2.TRIP負(fù)向調(diào)控TLR及RLR介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生
　　 2.1、TRIP抑制TLR3/4介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生
　　 為進(jìn)一步驗(yàn)證TRIP是否參與到TLR3/4介導(dǎo)的IFN-β的影響，我們構(gòu)建了TRIP的

21、表達(dá)載體，并在公司合成了小鼠TRIP的干擾RNA。在HEK293細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染TRIP的表達(dá)載體，進(jìn)行WesternBlotting，用相應(yīng)標(biāo)簽(FLAG,Myc)抗體孵育，發(fā)現(xiàn)TRIP表達(dá)良好。用淀粉誘導(dǎo)C57小鼠的巨噬細(xì)胞，轉(zhuǎn)染TRIP的干擾RNA，進(jìn)行Western Blotting，用TRIP特異性抗體孵育，發(fā)現(xiàn)TRIP干擾RNA的干擾效率很高。將TRIP干擾后的小鼠巨噬細(xì)胞用LPS，Poly(I:C)刺激細(xì)胞，通過RT-PCR及

22、ELISA分別檢測IFN-β的mRNA水平及分泌水平的變化，結(jié)果顯示，進(jìn)行干擾TRIP后，LPS，Poly(I:C)刺激的IFN-β的mRNA水平及分泌水平都出現(xiàn)明顯升高，這預(yù)示著TRIP可以負(fù)向調(diào)控TLR3/4介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生。
　　 為驗(yàn)證超表達(dá)TRIP后對TLR通路介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生是否有相反的效果，由于HEK293沒有TLR，因此我們選用了293-TLR3細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染TRIP表達(dá)質(zhì)粒24h，加Poly(I:C)

23、刺激，即刻活化TLR3信號通路，同時(shí)轉(zhuǎn)染IFN-β報(bào)告基因，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)的TRIP會抑制IFN-β的報(bào)告基因活性。
　　 2.2、TRIP抑制RIG-Ⅰ介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生
　　 用Poly(I:C)轉(zhuǎn)染HEK293的方法可以模擬活化RIG-Ⅰ信號通路，因此我們在HEK293中轉(zhuǎn)染TRIP超表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)TRIP會抑制轉(zhuǎn)染Poly(I:C)所介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生。RAW264.7細(xì)胞系瞬時(shí)轉(zhuǎn)染iNOS，GAS報(bào)告基因，用

24、IFN-γ刺激細(xì)胞，活化IFN信號通路，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的TRIP對IFN-γ介導(dǎo)的信號通路沒有影響，這也說明了TRIP對TLR和RLR信號通路的影響具有一定的特異性。
　　 用轉(zhuǎn)染小干擾RNA的方法將小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞的TRIP進(jìn)行干擾，用Sev感染細(xì)胞，活化RIG-Ⅰ信號通路，分別用RT-PCR，ELISA和報(bào)告基因方法檢測IFN-β的mRNA水平，分泌水平及報(bào)告基因活性水平的變化。結(jié)果顯示干擾TRIP后，Sev介導(dǎo)的IFN-β

25、的產(chǎn)生量明顯升高。
　　 3.TRIP調(diào)控IFN-β的分子機(jī)制
　　 3.1、TRIP負(fù)向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子IRF3活性
　　 IRF3是TLR，RLR活化產(chǎn)生IFN-β的最重要的轉(zhuǎn)錄因子，所以我們想探討TRIP會不會影響IRF3的活性，進(jìn)而影響IFN-β的產(chǎn)生。首先利用報(bào)告基因技術(shù)，將IRF3的報(bào)告基因與TRIP超表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染RAW264.7，用LPS，Poly(I:C)刺激活化TLR3/TLR4信號通路，或者將I

26、RF3報(bào)告基因與TRIP超表達(dá)共轉(zhuǎn)染HEK293，然后在轉(zhuǎn)染Poly(I:C)的方法活化RIG-Ⅰ信號通路，發(fā)現(xiàn)TRIP會抑制TLR及RLR介導(dǎo)的IRF3報(bào)告基因活性。將RIG-Ⅰ，MAVS及TBK1的超表達(dá)載體與IRF3報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染HEK293，活化IRF3報(bào)告基因，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)的TRIP會抑制IRF3的報(bào)告基因活性，這一方面說明TRIP會負(fù)向調(diào)控RLR介導(dǎo)的IRF3活性，另一方面說明，TRIP的作用靶點(diǎn)在TBK1或者更下游位置。

27、r>　　 進(jìn)而我們想探討TRIP會不會影響IRF3磷酸化情況，首先我們轉(zhuǎn)染TRIP超表達(dá)質(zhì)粒于HEK293中，然后轉(zhuǎn)染Poly(I:C)活化RLR信號通路，檢測蛋白磷酸化情況，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)TRIP可以降低RLR信號通路介導(dǎo)的IRF3磷酸化水平。將TRIP干擾RNA轉(zhuǎn)染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，36小時(shí)后，用Poly(I:C)刺激細(xì)胞，觀察磷酸化情況，發(fā)現(xiàn)干擾TRIP后TLR3介導(dǎo)的IRF3磷酸化水平明顯升高。
　　 3.2、TRIP的作

28、用靶點(diǎn)為TBK1
　　 為了確定TRIP在TLR及RLR信號通路中的作用靶點(diǎn)，我們將RIG-Ⅰ-，MAVS-，TBK1-，TRIF-及MDA5的表達(dá)載體與TRIP的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293，通過RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)TRIP負(fù)向調(diào)控這些接頭蛋白介導(dǎo)的IFN-β的rnRNA表達(dá)水平。同樣將RIG-Ⅰ-，MAVS-，TBK1-，TRIF-，MDA5，及IRF3-5D的表達(dá)載體與TRIP的表達(dá)載體和IFN-β報(bào)告基因的表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染

29、HEK293，報(bào)告基因結(jié)果表明，TRIP負(fù)向調(diào)控除IRF3以外的所有接頭蛋白介導(dǎo)的IFN-β的報(bào)告基因活性。以上結(jié)果說明了TRIP的作用靶點(diǎn)可能是TBK1而非IRF3。
　　 3.3、TRIP將TBK1進(jìn)行特異性的降解
　　 因?yàn)門RIP具有降解作用，但TRIP的作用靶點(diǎn)還不得而知，因此我們首先在腹腔原代巨噬細(xì)胞中將TRIP進(jìn)行干擾，分別用LPS，Poly(I:C)刺激細(xì)胞，進(jìn)行Western Blotting，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

30、對TRIP進(jìn)行干擾后，內(nèi)源性TBK1的表達(dá)量明顯升高，而IRF3，TRAF3，STAT1的表達(dá)并未受到影響。相反的，我們利高表達(dá)TRIP質(zhì)粒的RAW264.7穩(wěn)定株，重復(fù)上面的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)TRIP后，TBK1的表達(dá)量明顯降低，而TRAF3，TRAF6表達(dá)無變化。這說明在免疫細(xì)胞中，TRIP具有特異性降解TBK1的作用。將TBK1表達(dá)載體與TRAF3表達(dá)載體分別與TRIP表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)的TRIP可以抑制TB

31、K1載體的表達(dá)，而對TRAF3載體的表達(dá)沒有影響，當(dāng)加入蛋白酶體抑制劑后TRIP對TBK1載體表達(dá)的抑制作用消失。為了確定TBK1的激酶活性會不會因?yàn)榻到舛l(fā)生變化，我們進(jìn)行了激酶檢測實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明對TRIP進(jìn)行干擾后LPS介導(dǎo)的TBK1激酶活性的發(fā)生明顯增強(qiáng)。以上結(jié)果說明TBK1是TRIP的降解靶點(diǎn)，TBK1的激酶活性也因此受到TRIP的負(fù)向調(diào)控。
　　 3.4、TRIP將TBK1進(jìn)行K48位的泛素化
　　 泛素化是機(jī)

32、體內(nèi)常見的一種蛋白質(zhì)修飾形式，在TLR及RLR信號通路中發(fā)揮著重要的功能，K48位泛素化可以將目的蛋白進(jìn)行特異性的蛋白酶體方式降解。TRIP含有鋅指結(jié)構(gòu)域，之前也有文章預(yù)測其可能具有E3泛素連接酶功能，根據(jù)上面的降解實(shí)驗(yàn)，我們猜測TRIP可能會將TBK1進(jìn)行K48位泛素化。E3連接酶將目的分子泛素化的的前提是兩個(gè)分子發(fā)生結(jié)合，因此，首先我們將TBK1表達(dá)載體，IRF3表達(dá)載體與TRAF3表達(dá)載體分別與TRIP表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293，

33、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRIP可以與TRAF3，TBK1發(fā)生結(jié)合。將RAW264.7用LPS刺激后，用TBK1特異性抗體做免疫共沉淀，發(fā)現(xiàn)TRIP可以與TBK1發(fā)生內(nèi)源性結(jié)合.由于TRIP僅對TBK1進(jìn)行降解，對TRAF3沒有作用，因此我們猜測，TRIP的泛素化靶點(diǎn)應(yīng)該是TBK1.
　　 我們要進(jìn)一步確定TRIP是否能將TBK1進(jìn)行泛素化，首先我們將野生型TRIP，E3連接酶活性缺失點(diǎn)突變TRIP與TBK1表達(dá)載體，泛素表達(dá)載體

34、共轉(zhuǎn)染HEK293，免疫共沉淀后發(fā)現(xiàn)，TRIP可以將TBK1進(jìn)行泛素化。進(jìn)一步要證明泛素化以何種形式進(jìn)行，我們將TRIP表達(dá)載體，TBK1表達(dá)載體分別于野生型泛素表達(dá)載體，K48位點(diǎn)突變泛素表達(dá)載體，K63位泛素表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293，免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)，TRIP可以將TBK1進(jìn)行K48位泛素化而非K63位泛素化。
　　 4.TRIP抵抗病毒的生理意義
　　 4.1、TRIP抑制病毒介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生
　　

35、IFN-β在機(jī)體抵抗機(jī)體抵抗病的的重要分子，前面已經(jīng)證明TRIP可以負(fù)向調(diào)控RIG-1介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生，那么TRIP會不會影響病毒介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生，進(jìn)而影響VSV的復(fù)制？首先將TRIP過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293，進(jìn)而用Sev感染細(xì)胞活化IFN-β的產(chǎn)生，RT-PCR及ELISA結(jié)果顯示，TRIP過表達(dá)可以負(fù)向調(diào)控Sev介導(dǎo)的IFN-β及RANTES的產(chǎn)生。在HEK293中利用共轉(zhuǎn)染及報(bào)告基因技術(shù)，我們可以看到TRIP可以負(fù)向

36、調(diào)控Sev介導(dǎo)的IFN-β報(bào)告基因活性。而將TRIP在小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞中進(jìn)行干擾后，再用Sev感染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾TRIP后Sev介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生明顯升高。將TRIP在HEK293中進(jìn)行過表達(dá)，Sev感染后進(jìn)行非變性電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TRIP會抑制IRF3的二聚化。在HEK293中轉(zhuǎn)染TRIP超表達(dá)載體，用Sev刺激時(shí)間點(diǎn)，WesternBlotting結(jié)果顯示，干擾TRIP可以促進(jìn)內(nèi)源性TBK1的表達(dá)，磷酸激酶實(shí)驗(yàn)同樣證明T

37、RIP可以降低TBK1的激酶活性。這些結(jié)果說明TRIP可以負(fù)向調(diào)控Sev介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生。
　　 4.2、TRIP促進(jìn)病毒的逃逸
　　 前面一系列結(jié)果展示了TRIP可以影響病毒介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生，我們想探討TRIP是否可以直接調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制。我們選用了VSV病毒，該病毒同Sev一樣是單鏈RNA病毒，可以活化RIG-Ⅰ介導(dǎo)的IFN-β，且更適用于病毒空斑實(shí)驗(yàn)研究。首先將TRIP過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293，24小時(shí)

38、后，用Poly(I:C)轉(zhuǎn)染HEK293，6小時(shí)后用VSV感染，培養(yǎng)24小時(shí)收集上清及細(xì)胞RNA，結(jié)果顯示，過表達(dá)TRIP可以直接促進(jìn)VSV的復(fù)制，而TRIP的E3連接酶活性缺失突變體則失去這一功能。將TRIP的干擾RNA轉(zhuǎn)染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，36小時(shí)后用Poly(I:C)刺激細(xì)胞，6小時(shí)后再用VSV感染，24小時(shí)后收集上清及細(xì)胞RNA,結(jié)果顯示，將TRIP進(jìn)行干擾后可以直接抑制VSV的復(fù)制。
　　 四.結(jié)論及創(chuàng)新性
　　

39、 1.世界上首次證明TBK1的K48位泛素化調(diào)控方式
　　 TBK1是固有免疫信號通路中非常重要的一員，通過其磷酸激酶活性調(diào)控大量基因的表達(dá)，TBK1激酶活性是如何調(diào)控的還不太清楚。已有文獻(xiàn)報(bào)道，TBK1可以被磷酸化或K63位泛素化，進(jìn)而促進(jìn)TBK1及活化，但TBK1如何被負(fù)向調(diào)控至今仍未有報(bào)道，我們首次證明TBK1可以被TRIP進(jìn)行K48位泛素化，進(jìn)而發(fā)生降解，完善了RLR及TLR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。
　　 2.首次證明

40、了TRIP具有體內(nèi)泛素化功能
　　 已有報(bào)道對TRIP的結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行了預(yù)測，猜測TRIP是一種E3泛素連接酶，并進(jìn)行了體外泛素化驗(yàn)證，但TRIP是否在體內(nèi)具有泛素化功能，其作用靶點(diǎn)是什么都還不知道，我們的研究證明TRIP在體內(nèi)的確是一種E3連接酶，并通過其泛素化功能調(diào)節(jié)TLR劑RLR信號通路。
　　 3.揭示了一條新的病毒逃逸機(jī)制
　　 病毒感染機(jī)體后，機(jī)體會對病毒殺傷，而病毒也會產(chǎn)生抵抗機(jī)體的逃逸機(jī)制，兩種作用

41、相互抗衡。我們研究發(fā)現(xiàn)單鏈RNA病毒感染機(jī)體后產(chǎn)生IFN-β殺傷病毒，同時(shí)病毒會誘導(dǎo)機(jī)體高表達(dá)TRIP，高表達(dá)的TRIP負(fù)反饋調(diào)控RLR及TLR信號通路，關(guān)閉IFN-β的生成，促進(jìn)病毒的逃逸。
　　 4.為抗病毒藥物的研發(fā)提供了新的靶點(diǎn)
　　 目前全世界病毒泛濫，如HBV，HIV，SARS以及剛剛發(fā)現(xiàn)的H7N9等，因此生產(chǎn)研發(fā)針對病毒的藥物迫在眉睫，通過我們的研究，可以提出一個(gè)假設(shè):如果我們篩選出一種可以特異性降低TRI