表達(dá)豬瘟病毒E2-E0蛋白的犬2型腺病毒活載體重組疫苗株的構(gòu)建.pdf

1、豬瘟是豬的一種高度接觸性傳染病，死亡率很高。給養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前在我國廣泛使用的預(yù)防豬瘟的疫苗為豬瘟兔化弱毒疫苗株(國外稱為C株)，具有免疫力強(qiáng)，保護(hù)率高且持久，遺傳穩(wěn)定、無殘余毒力等優(yōu)點(diǎn)，是國際上公認(rèn)的效果最好的豬瘟弱毒疫苗，該弱毒疫苗的使用為防制豬瘟起到了十分重要的作用，但是弱毒疫苗免疫的最大缺點(diǎn)是難以用血清學(xué)方法與自然感染區(qū)分開，不利于豬瘟的凈化及消滅。面對十多年來豬瘟病毒在大規(guī)模免疫接種壓力下出現(xiàn)的各種復(fù)雜情況，

2、探索研制豬瘟病毒的安全高效而又實(shí)用的新型疫苗，為我國控制及最終消滅豬瘟找到一種切實(shí)可行的方法和手段，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中，構(gòu)建了以犬2型腺病毒(CAV-2)弱毒為載體的表達(dá)O型口蹄疫病毒VPl蛋白的重組CAV-2-VP1疫苗，免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，該重組疫苗可誘發(fā)機(jī)體針對口蹄疫病毒和CAV-2的免疫應(yīng)答，提示我們以CAV-2為載體構(gòu)建重組疫苗用于豬的免疫是可行的。本研究選擇豬瘟病毒兔化弱毒株E0，E2糖蛋白作為

3、保護(hù)性抗原，分別構(gòu)建重組CAV-2病毒。同時對重組病毒進(jìn)行豬免疫試驗(yàn)，檢測重組病毒免疫原性，制備豬瘟重組活載體疫苗候選株，為豬瘟重組活載體疫苗研究奠定基礎(chǔ)。 研究首先在前期獲得的CAV-2感染性全基因組質(zhì)粒pPolyⅡ-CAV-2的基礎(chǔ)上，對其E3區(qū)進(jìn)行缺失，分別捅入豬瘟病毒兔化弱毒株糖蛋白E0，E2基因的表達(dá)盒，轉(zhuǎn)染犬腎細(xì)胞系，成功獲得兩株重組病毒CAV-2-CSFV-E0、CAV-2-CSFV-E2。 對這兩株重組病

4、毒進(jìn)行了生物學(xué)特性的研究，通過電鏡觀察、細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID<,50>)測定、血凝和血凝抑制試驗(yàn)，檢測病毒的形態(tài)、反應(yīng)原性、生長特性。通過PCR、RT-PCR、Westem-blot方法對重組病毒的遺傳穩(wěn)定性和糖蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)量進(jìn)行了檢測。研究結(jié)果顯示，各株重組病毒具有典型的腺病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)；相同TCID<,50>的重組病毒和母源病毒都能凝集人的紅細(xì)胞，血凝效價(jià)沒有差別；相同TCID<,50>重組病毒和母源病毒接種DK細(xì)胞，病毒

5、增殖特性與母源病毒沒有差異；重組病毒在體外連續(xù)傳30代，性質(zhì)穩(wěn)定，沒有出現(xiàn)外源基因的缺失和重排；重組病毒感染細(xì)胞后能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄和表達(dá)豬瘟病毒糖蛋白，具有良好的反應(yīng)原性。 應(yīng)用這兩株重組病毒對一月齡斷乳仔豬進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，通過口服免疫途徑免疫。試驗(yàn)中受試豬共24頭，分為5組，前3組每組6頭，前兩組分別口服免疫重組毒CAV-2-CSFV-E0、CAV-2-CSFV-E2，第3組為CAV-2-CSFV-E0和CAV-2-CSFV-E2聯(lián)

6、合免疫，第4組為CAV-2對照組，第5組為豬瘟兔化弱毒活疫苗對照組，對照組分別設(shè)3頭豬。免疫時每頭豬口服2mL(10<'8>TCID<,50>/0.1 mL)病毒，免疫前及免疫后定期采血，連續(xù)12周。經(jīng)Western-blot分析抗體組成；HI檢測腺病毒抗體血凝抑制效價(jià)；熒光抗體試驗(yàn)和ELISA測定抗體中和效價(jià)。結(jié)果顯示，兩株重組毒在豬體內(nèi)同時誘導(dǎo)產(chǎn)生了針對豬瘟病毒和腺病毒的兩種特異性抗體。HI試驗(yàn)表明，各株重組毒與CAV-2病毒血凝效