PDX-1真核表達(dá)載體構(gòu)建及其在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、背景和目的：
　　 目前，糖尿病的治療方法不能使所有糖尿病患者血糖理想控制，胰島細(xì)胞移植治療糖尿病引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，但異體胰島細(xì)胞移植由于胰島細(xì)胞來源不足和免疫排斥反應(yīng)等問題限制了其臨床應(yīng)用。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是存在于骨髓中具有高度自我更新和多向分化潛能的一類非造血干細(xì)胞，可以分化為內(nèi)胚層的細(xì)胞如胰島樣細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等[1-3]

2、。MSCs取材方便、易于分離培養(yǎng)，體外擴(kuò)增能力強(qiáng)，遺傳性能穩(wěn)定，易于轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達(dá)外源基因，避免免疫排斥反應(yīng)，且不存在人胚胎干細(xì)胞的倫理、道德問題，是細(xì)胞和組織工程理想的種子細(xì)胞，逐漸成為人們尋找治療糖尿病所需的胰島樣細(xì)胞的新來源。
　　 胰腺一十二指腸同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1)在人類又被稱為胰島素啟動因子-1(insulin promoter factor-1，IPF

3、-1)，是胰腺發(fā)育早期表達(dá)的一個轉(zhuǎn)錄因子，不僅對于腸內(nèi)胚層背側(cè)及腹側(cè)胰腺萌芽的生長分化起著重要的作用[4]，還參與了胰島細(xì)胞分化發(fā)育成熟的過程。
　　 本研究擬構(gòu)建含有PDX-1基因的真核表達(dá)載體，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將所構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大鼠BMSCs中，篩選穩(wěn)定表達(dá)株細(xì)胞，為后續(xù)研究即誘導(dǎo)其向胰島樣細(xì)胞分化及移植治療糖尿病做好前期準(zhǔn)備。
　　 方法：
　　 1.PDX-1基因cDNA片段的克隆及真核表達(dá)載

4、體的構(gòu)建
　　 1.1根據(jù)GenBank上登錄的PDX-1的cDNA全長序列設(shè)計引物。以提取的總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，然后進(jìn)行測序并與GenBank上的PDX-1基因序列進(jìn)行比對分析。
　　 1.2重組載體的構(gòu)建與鑒定
　　 測序鑒定正確的重組質(zhì)粒分別用引物對應(yīng)的酶切位點進(jìn)行雙酶切，回收相應(yīng)的片段。同樣對真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)及綠色熒光蛋白載體p

5、EGFP-C1進(jìn)行相應(yīng)的酶切，回收載體片段。用T4DNA連接酶分別連接上述回收的片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109細(xì)胞，涂板，過夜培養(yǎng)，挑取克隆，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定。
　　 2.大鼠BMSCs的體外培養(yǎng)及篩選含PDX-1的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株
　　 2.1利用全骨懿貼壁培養(yǎng)法分離、原代培養(yǎng)BMSCs
　　 2.2 BMSCs表面標(biāo)記鑒定及生長曲線測定
　　 2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　 2.4熒光顯微鏡觀

6、察pEGFP-PDX-1基因定位
　　 2.5利用遺傳霉素(Geneticin，G418)篩選轉(zhuǎn)染重組載體pcDNA3.1(+)-IPDX-1的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株細(xì)胞
　　 2.6 RT-PCR檢測PDX-1基因的表達(dá)
　　 結(jié)果：
　　 1.提取的總RNA完整性好，無降解。PDX-1基因的克隆，擴(kuò)增出特異的DNA條帶，約883bp，與預(yù)期結(jié)果相符。經(jīng)HindIII和BamHI雙酶切鑒定及測序分析，重組載體含有大

7、小、方向和讀碼框均正確的插入片段。
　　 2.分離獲得原代大鼠BMSCs，細(xì)胞免疫熒光示CD29、CD44陽性表達(dá)，CD34陰性表達(dá)，符合BMSCs特征。pEGFP-PDX-1基因定位：熒光顯微鏡觀察顯示轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-C1的細(xì)胞，綠色熒光分布于整個細(xì)胞，而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-PDX-1的細(xì)胞，細(xì)胞中央熒光更濃，提示細(xì)胞轉(zhuǎn)染定位于細(xì)胞核。
　　 3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的篩選與鑒定
　　 RT-PCR結(jié)果顯示未處

8、理正常組BMSCs和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體的陰性對照組無PDX-1目的片段。pcDNA3.1(+)-PDX-1轉(zhuǎn)染株中擴(kuò)增出PDX-1基因的目的片段，證明PDX-1基因成功轉(zhuǎn)入BMSCs并獲得pcDNA3.1(+)-PDX-1的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究成功克隆小鼠PDX-1基因片段，并構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體
　　 2.通過融合綠色熒光蛋白的真核表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染，證明轉(zhuǎn)入的PDX-1基因