剛地弓形蟲14-3-3蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá).pdf

1、剛地弓形蟲是一種呈世界性分布的重要機會性致病原蟲，專性寄生細(xì)胞內(nèi)，人與動物均能感染，引起人獸共患弓形蟲病。正常情況下，宿主感染弓形蟲后，呈隱性狀態(tài)。但在宿主免疫功能低下時，如器官移植、AIDS、惡性腫瘤等患者，弓形蟲可引起器官損害，導(dǎo)致嚴(yán)重后果。孕婦感染弓形蟲可致流產(chǎn)、死產(chǎn)和早產(chǎn)，存活者也?；加谢魏椭橇φ系K等嚴(yán)重后遺癥。除感染人外，弓形蟲也可感染家畜，引起羊等多種家畜的流產(chǎn)和大量死亡，給全世界的畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失和影響其發(fā)展。

2、同時，帶蟲家畜是人感染弓形蟲的主要傳染源。
　　 近年來，在真核細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路研究中，發(fā)現(xiàn)了一組關(guān)鍵信號蛋白14-3-3蛋白家族。14-3-3蛋白是廣泛存在于植物、酵母、原蟲、蠕蟲、昆蟲和包括人在內(nèi)的多種動物真核細(xì)胞內(nèi)的一種高度保守蛋白。它參與很多細(xì)胞正常生命活動的調(diào)節(jié)。據(jù)資料推測，14-3-3蛋白也可能在弓形蟲細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要的調(diào)節(jié)作用。
　　 目的:構(gòu)建剛地弓形蟲RH株14-3-3蛋白的真核表達(dá)載體，并在真核

3、細(xì)胞內(nèi)表達(dá)該載體，為研究弓形蟲中此蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:首先利用生物信息學(xué)方法對弓形蟲14-3-3蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。用基因工程的方法，以弓形蟲RH株總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴增目的基因片段。與pEASY-T1克隆載體連接，篩選出陽性克隆，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后，亞克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-C1。經(jīng)過PCR、雙酶切和測序鑒定后，將構(gòu)建好的真核表達(dá)載體pEGFP/14-3-3轉(zhuǎn)染HEK

4、293細(xì)胞，用熒光顯微鏡觀察其在HEK293細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況，Western-blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物。
　　 結(jié)果:預(yù)測14-3-3蛋白分子為酸性可溶性蛋白。14-3-3二級結(jié)構(gòu)由Alphahelix(Hh)、Extended strand(E)e及Random coil(Cc)組成。3D結(jié)構(gòu)顯示14-3-3蛋白主要以同源或異源二聚體存在，形成一個U型結(jié)構(gòu)。14-3-3單體是由9個反向平行的α螺旋(Hh)構(gòu)成。發(fā)現(xiàn)約5個氨基酸保守序

5、列區(qū)，與結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的位點高度保守。RT-PCR擴增出的基因片段約800bp，構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP/14-3-3經(jīng)PCR、雙酶切鑒定正確。測序結(jié)果表明，其具有一個801bp完整的開放閱讀框，與GenBank中剛地弓形蟲14-3-3蛋白基因序列(登錄號為AB012775.1)同源性為99％。熒光顯微鏡下觀察到重組質(zhì)粒能夠在HEK293細(xì)胞中表達(dá)。Western-blot分析結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染pEGFP/14-3-3重組質(zhì)粒的細(xì)胞中