硼替佐米對(duì)柔紅霉素誘導(dǎo)的K562耐藥細(xì)胞株NF-κB、IκB及P-gp表達(dá)的影響.pdf

1、核因子(nuclear factor—kappa B，NF—κ B)是普遍存在于真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。正常狀態(tài)下，它與抑制蛋白(inhibitor protein，Ⅰκ B)在細(xì)胞漿中結(jié)合。當(dāng)應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生時(shí)，Ⅰκ B磷酸化并被蛋白酶體識(shí)別降解，NF—κ B被釋放，進(jìn)入細(xì)胞核，與特異的κB序列結(jié)合，誘導(dǎo)或上調(diào)多耐藥基因(mdrl基因)的表達(dá)，其產(chǎn)生的P—糖蛋白(P—glycoprotein，P—gp)是ATP依賴性的藥物泵，可將進(jìn)入細(xì)

2、胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降，從而出現(xiàn)耐藥。 硼替佐米(PS—341)是蛋白酶體抑制劑類抗腫瘤藥物，臨床主要用于復(fù)發(fā)及難治性多發(fā)性骨髓瘤的治療，在白血病治療方面的應(yīng)用仍處于理論研究和探索階段。本研究采用體外實(shí)驗(yàn)的方法觀察PS—341對(duì)柔紅霉素(daunorubicin，DNR)誘導(dǎo)的K562/DNR細(xì)胞株NF—κ B、Ⅰκ B及P—gp表達(dá)的影響，探討PS—341逆轉(zhuǎn)耐藥的分子機(jī)制和作用特點(diǎn)，為臨床克服白血病多藥耐藥

3、提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料： 一、實(shí)驗(yàn)對(duì)象 人白血病多藥耐藥細(xì)胞株K562/DNR由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室友情提供。該細(xì)胞株由濃度為0.5mmol/L DNR刺激而成，并維持其耐藥活性。 二、主要儀器和試劑 1、MTT法檢測(cè)細(xì)胞耐藥性相關(guān)試劑 2、兔抗人NF—κ B、Ⅰκ B及P—gp一抗(美國(guó)SANTA CRUZ公司) 3、堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔和馬抗小鼠二抗(北

4、京中山公司) 4、鼠抗β—actin(美國(guó)Sigrna公司) 5、NF—κ B活性試劑盒(美國(guó)Active Motif公司) 6、流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(北京寶賽) 7、PS—341(西安楊森公司) 實(shí)驗(yàn)方法： 一、細(xì)胞培養(yǎng) K562/S、K562/DNR細(xì)胞使用含有12％胎牛血清、100U/ml的青霉素和100ug/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃、5％ CO

5、2和飽和濕度條件下培養(yǎng)。 二、MTT法進(jìn)行耐藥細(xì)胞株的判定 實(shí)驗(yàn)分組：K562/S和K562/DNR組；將細(xì)胞質(zhì)量濃度調(diào)整為2×105/mL，在96孔板上接種，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)5個(gè)平行孔。72h后，每孔加入MTT(5g/L)20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心棄上清，加二甲基亞砜(DMSO)150μL終止反應(yīng)，避光振蕩15min，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)570nm吸光度(A)值，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率和耐藥倍數(shù)。 三、MTT法分析測(cè)

6、定PS—341的直接細(xì)胞毒活性 具體方法同上，每孔加入不同濃度的PS—3410.4 u g/L、4 ug/L及40 u g/L，以空白對(duì)照組的吸光度值作為100％生存率，各濃度組的相對(duì)生存率(％)=每實(shí)驗(yàn)組吸光值/空白組吸光值×100％。通過計(jì)算求得90％生存率時(shí)的PS—341劑量即IC10。選取低于IC10的一個(gè)濃度作為PS—341逆轉(zhuǎn)耐藥的實(shí)驗(yàn)濃度。 四、Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞NF—κ B、Ⅰκ B及P

7、—gp表達(dá)情況 以100 ug/ml DNR單用或聯(lián)合應(yīng)用0.4 ug/L、4 ug/L及40 u g/L PS—341作用于K562耐藥細(xì)胞株36h，以100 ug/ml DNR單用或聯(lián)合應(yīng)用4 u g/L PS—341作用于K562耐藥細(xì)胞株12h、24h和36h。取各組1×107細(xì)胞，加入反應(yīng)體系，提取細(xì)胞的總蛋白并經(jīng)Larry法定量，取50μg蛋白上樣到15％的SDS—聚丙烯酰胺凝膠，電泳。印跡轉(zhuǎn)膜后，用抗NF—κ B、

8、ⅠκB及P—gp抗體和抗β—actin抗體孵育，最后加入相應(yīng)二抗，用顯色劑進(jìn)行顯色后用凝膠成像儀分析圖像。 五、ELISA法進(jìn)行NF—κ B活性檢測(cè) 核蛋白提取方法及實(shí)驗(yàn)操作步驟按試劑盒(Activemotif公司產(chǎn)品)說明進(jìn)行。 六、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 分別收集各組的細(xì)胞，Annexin—Ⅴ—FITC雙染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算凋亡百分?jǐn)?shù)，記錄、儲(chǔ)存和分析結(jié)果。 七、統(tǒng)計(jì)方法 所有

9、指標(biāo)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS11.5軟件進(jìn)行方差分析和各組間率的比較。P<0.05認(rèn)為差別有顯著性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、DNR對(duì)K562/S組細(xì)胞的IC50值為1.16μg/mL，對(duì)K562/DNR組細(xì)胞的IC50值為50.43μg/mL，耐藥倍數(shù)為43.47。 2、PS—341作用于K562/DNR細(xì)胞株的IC10為4 u g/L。即當(dāng)PS—341濃度低于4 u g/L時(shí)，90％細(xì)胞存活，可認(rèn)為此濃度的P

10、S—341本身無直接細(xì)胞毒作用。 3、與陰性對(duì)照組相比，DNR可誘導(dǎo)NF—κ B表達(dá)上調(diào)、活性增強(qiáng)，Ⅰκ B表達(dá)下調(diào)，P—gp表達(dá)上調(diào)； 4、加用PS—341可顯著抑制DNR誘導(dǎo)的NF—κ B及P—gp表達(dá)，降低NF—κ B活性，其作用呈濃度和時(shí)間依賴性。 5、與對(duì)照組相比，DNR組、40 u g/L PS—341組及DNR聯(lián)合應(yīng)用不同濃度PS—341組，細(xì)胞凋亡率明顯增加，而0.4 ug/L PS—341組及4

11、 ug/L PS—341組細(xì)胞凋亡率變化不明顯；與DNR處理組相比，加入PS—341后可提高DNR引起的細(xì)胞凋亡率，且隨PS—341濃度的增加，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加；與40 ug/L PS—341組相比，DNR聯(lián)合40 ug/L PS—341后細(xì)胞凋亡率增加；與相應(yīng)DNR組相比，加入PS—341后可提高DNR引起的細(xì)胞凋亡率，且隨PS—341作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加。 結(jié)論： 硼替佐米可減少K562/DNR細(xì)