維甲酸耐藥細(xì)胞與敏感細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析.pdf

1、目的：比較維甲酸耐藥細(xì)胞與敏感細(xì)胞的差異蛋白表達(dá)譜，分析、篩選維甲酸耐藥相關(guān)蛋白，以探討維甲酸的耐藥機(jī)制。 方法：1、提取維甲酸敏感細(xì)胞株NB4及維甲酸耐藥細(xì)胞株MR2的全蛋白，進(jìn)行雙向凝膠電泳分離，經(jīng)PDQuestv7.1分析軟件篩選出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，質(zhì)譜分析獲得差異蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋圖譜，以此通過(guò)Mascot軟件查詢(xún)SWISS-PROT蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)、進(jìn)行差異蛋白質(zhì)的鑒定，獲得候選維甲酸耐藥相關(guān)蛋白。 2、采用wes

2、ternblotting及半定量RT-PCR在蛋白水平和mRNA水平對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果：1、獲得了分辨率高、重復(fù)性好的APL細(xì)胞的雙向電泳圖譜，維甲酸敏感細(xì)胞株NB4和維甲酸耐藥細(xì)胞株MR2的pI4-7雙向凝膠電泳圖譜顯示平均蛋白點(diǎn)分別為890±45和912±56。在二者間分析到57個(gè)差異蛋白點(diǎn)，23個(gè)蛋白在RA耐藥細(xì)胞株MR2中上調(diào)，34個(gè)蛋白下調(diào)。25個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜鑒定，17個(gè)獲得成功鑒定，對(duì)應(yīng)于13個(gè)ORF

3、，其中一個(gè)是未知功能的新蛋白FLJ00279，其余分屬于癌蛋白DJ-1、轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白(MYCpromoterbindingprotein1)、分子伴侶(HSP70、HSP60及proteindisulfideisomerase)、代謝類(lèi)蛋白(prohibitin、Triosephosphateisomerase1及calreticulin)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(RhoGDPdissociationinhibitorbeta)以及細(xì)胞骨架蛋白(AC

4、TG1protein、Beta5-tubulin及keratin10)。 2、半定量RT-PCR顯示HSP70和HSP60的蛋白質(zhì)表達(dá)差異與mRNA水平變化無(wú)相關(guān)一致性。westernblotting試驗(yàn)展現(xiàn)了DJ-1和calreticulin在多個(gè)異構(gòu)體上的差異表達(dá)。兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示翻譯后蛋白的修飾或剪切介導(dǎo)了蛋白的表達(dá)差異。 3、酸化的DJ-1蛋白異構(gòu)體可能參與維甲酸耐藥；不同質(zhì)量的calreticulin可能在細(xì)胞

5、凋亡及分化兩條途徑干擾維甲酸作用；HSP70、HSP60、Prohibitin以及MYCpromoterbindingprotein1也可能從不同角度介導(dǎo)維甲酸耐藥產(chǎn)生。 結(jié)論：應(yīng)用雙向凝膠電泳連接質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選到新蛋白FLJ00279以及功能已知的DJ-1、calreticulin、HSP70、HSP60、Prohibitin及MYCpromoterbindingprotein1等維甲酸耐藥相關(guān)蛋白，雖然它們與維甲酸