維甲酸受體激動(dòng)劑Am80調(diào)節(jié)KLF5與RARα相互作用的分子機(jī)制.pdf

1、目的：血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的增殖和分化受由一系列調(diào)節(jié)因子構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，促增殖因子，如Krüppel樣因子5（KLF5）與促分化因子，如維甲酸受體（RAR）在功能上相互影響、相互制約，共同參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化及凋亡等過(guò)程的調(diào)節(jié)。已經(jīng)證明，KLF5通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的表達(dá)而促進(jìn)多種細(xì)胞增殖。在心血管系統(tǒng)，KLF5通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖而在心血管重塑過(guò)程中扮演重要的角色。RAR是一類重要的核受體，與其特異性配體

2、結(jié)合后，通過(guò)激活或抑制一系列基因的表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞分化。目前已分離到三種RAR亞型：RARα，RARβ和RARγ。大量研究表明，VSMC中存在與維甲酸結(jié)合的RARα，通過(guò)該受體，維甲酸及其衍生物能促進(jìn)VSMC分化，抑制其過(guò)度增殖。本實(shí)驗(yàn)研究Am80與RARα相互作用所激活的信號(hào)通路及其抑制KLF5與RARα相互作用的分子機(jī)制。
　　 方法：用貼塊法分離、培養(yǎng)大鼠VSMC，胰蛋白酶消化傳代，取3～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過(guò)免疫共沉淀研究

3、KLF5與RARα相互作用，Western blot分析檢測(cè)Am80對(duì)KLF5和RARα表達(dá)及不同信號(hào)通路抑制劑對(duì)信號(hào)通路活化、KLF5磷酸化以及KLF5與RARα相互作用的影響。
　　 結(jié)果：⑴2μM Am80刺激VSMC不同時(shí)間和不同濃度Am80刺激細(xì)胞24 h，RARα的表達(dá)水平呈時(shí)間和劑量依賴性升高；而KLF5的表達(dá)水平則呈時(shí)間和劑量依賴性降低。提示，Am80能誘導(dǎo)RARα表達(dá)，抑制KLF5表達(dá)；⑵提取被Am80刺激不同

4、時(shí)間（0、0.5、1、2 h）的VSMC總蛋白，進(jìn)行交互免疫共沉淀。結(jié)果顯示，在Am80刺激前后的VSMC中，KLF5和RARα均可被共沉淀，提示KLF5與RARα之間存在相互作用。Am80刺激后，免疫沉淀物中的KLF5和RARα均明顯減少，說(shuō)明Am80抑制二者之間的相互作用。與對(duì)照組相比，二者之間的結(jié)合在Am80刺激0.5h和1 h明顯降低，2 h基本恢復(fù)至刺激前水平。與正常組和模型組相比，給藥3天組的動(dòng)物模型血管組織中，KLF5與R

5、ARα的相互作用顯著減少。14天后二者之間的交互作用有所增強(qiáng)，但仍明顯低于正常組及模型組；⑶Am80作用于VSMC0.5 h，KLF5的磷酸化水平迅速降低，2 h回升。表明Am80能誘導(dǎo)KLF5快速脫磷酸化。且KLF5的磷酸化水平變化與它和RARα的結(jié)合活性變化相一致。提示Am80通過(guò)誘導(dǎo)KLF5脫磷酸化抑制其與RARα的相互作用。Am80刺激VSMC0.5 h，Akt的磷酸化水平明顯升高，并持續(xù)至刺激后2 h。與之相反，p38磷酸化水

6、平于Am80刺激后0.5 h明顯降低，并持續(xù)至刺激后2 h。上述結(jié)果提示，在VSMC中，Am80能激活PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制p38MAPK信號(hào)通路，這兩條通路在Am80誘導(dǎo)KLF5脫磷酸及抑制KLF5與RARα相互作用過(guò)程中發(fā)揮重要的作用；⑷為進(jìn)一步證明Am80誘導(dǎo)KLF5脫磷酸化與Akt信號(hào)通路激活有關(guān)，用Akt抑制劑LY294002預(yù)處理VSMC2 h，再用Am80刺激細(xì)胞1 h后，檢測(cè)KLF5磷酸化水平。結(jié)果顯示，LY29

7、4002能明顯抑制Am80誘導(dǎo)的KLF5脫磷酸化。同時(shí)，交互免疫共沉淀結(jié)果表明，LY294002能逆轉(zhuǎn)Am80對(duì)KLF5與RARα相互結(jié)合的抑制作用。上述結(jié)果進(jìn)一步表明，Am80通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)KLF5脫磷酸化，進(jìn)而抑制其與RARα的相互作用；⑸為探討p38 MAPK信號(hào)通路在KLF5磷酸化修飾中的作用，應(yīng)用p38持續(xù)活化型質(zhì)粒pSV-mkk6b轉(zhuǎn)染VSMC，收集細(xì)胞檢測(cè)KLF5磷酸化水平。結(jié)果表明，持續(xù)激活p38 MA

8、PK信號(hào)通路能明顯抑制Am80誘導(dǎo)的KLF5脫磷酸化。用p38抑制劑SB203580（20μM）預(yù)孵育細(xì)胞2 h后，給予Am80刺激1 h，收集細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀分析。結(jié)果表明，SB203580能進(jìn)一步增強(qiáng)Am80對(duì)KLF5與RARα相互作用的抑制作用。表明，Am80通過(guò)p38MAPK信號(hào)通路抑制KLF5磷酸化，進(jìn)而抑制其與RARα的相互作用；⑹Akt抑制劑LY294002能逆轉(zhuǎn)Am80對(duì)p38磷酸化的抑制作用，而p38抑制劑SB203

9、580對(duì)Akt的磷酸化修飾無(wú)明顯影響。提示，在Am80刺激的VSMC中，PI3K/Akt與p38 MAPK信號(hào)通路之間存在信號(hào)交談，前者位于后者上游。
　　 結(jié)論：①Am80誘導(dǎo)RARα表達(dá)，抑制KLF5表達(dá)；②Am80抑制KLF5與RARα相互作用；③Am80通過(guò)PI3K/Akt通路誘導(dǎo)KLF5脫磷酸化，進(jìn)而抑制KLF5與RARα相互作用；④PI3K/Akt與p38 MAPK信號(hào)通路之間存在信號(hào)交談，前者系后者的上游信號(hào)分子。