加味玉屏風顆粒應用于變態(tài)反應性皮膚病的實驗及臨床研究.pdf

1、[背景] 近年來，全世界變態(tài)反應性疾病的發(fā)病率明顯上升。在所有的變態(tài)反應性疾病中，皮膚變態(tài)反應性疾病的發(fā)病率最高。因此，對于變態(tài)反應性皮膚病的研究，探討如何有效地預防及治療，是目前皮膚病研究的熱點之一。 祖國傳統(tǒng)醫(yī)學對該類疾病的中醫(yī)病機進行了深入的研究，通過辨證施治，取得了良好的療效。實驗證明，許多中藥單體或復方均能從多層次多途徑來抑制機體變態(tài)反應的產(chǎn)生，并且具有傳統(tǒng)西藥所不具備的綜合藥理作用優(yōu)勢。因此，運用現(xiàn)代實驗技術(shù)

2、研究傳統(tǒng)中草藥，尤其是純天然藥物制成的小復方制劑，將為該類疾病的臨床防治提供新的思路。 玉屏風散是中醫(yī)扶正固表的經(jīng)典方劑，由黃芪佐以白術(shù)、防風構(gòu)成。在臨床上廣泛用于治療哮喘、上呼吸道感染等疾病，較少有對其治療變態(tài)反應性皮膚病的實驗室研究。因此，根據(jù)中醫(yī)固本驅(qū)邪的理論依據(jù)及臨床經(jīng)驗，我們在玉屏風散原方基礎(chǔ)上添加荊芥、當歸、甘草等藥物，本著益氣固表、養(yǎng)血祛風的治則，在臨床上治療變態(tài)反應性皮膚病，取得良好療效。并進一步在實驗室建立變應

3、性接觸性皮炎(ACD)小鼠模型，運用多種實驗技術(shù)對加味玉屏風顆粒治療變態(tài)反應性皮膚病的作用機制及環(huán)節(jié)進行深入的研究。 [目的] 1、通過研究加味玉屏風顆粒對變應性接觸性皮炎小鼠的多種臨床指標的改善，從而探討加味玉屏風顆粒的藥理學功效。 2、通過研究加味玉屏風顆粒對核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB表達的影響，探討其抑制Ⅳ型變態(tài)反應的可能作用機制。 3、通過研究加味玉屏風顆粒對小鼠外周血多種細胞因子的影響，探討其對ACD

4、小鼠機體免疫系統(tǒng)，尤其是對Ⅰ型及Ⅱ型細胞因子的影響。 4、通過臨床應用加味玉屏風顆粒治療變態(tài)反應性皮膚病，對其人體療效做出評價。 5、觀察加味玉屏風顆粒對濕疹患者外周血T淋巴細胞亞群的影響，探討其對濕疹患者細胞免疫的影響。 [方法] 1、建立小鼠變應性接觸性皮炎模型 取BALB/C小鼠50只，用DNFB作為誘導劑，實驗動物于實驗前一天于腹部去毛，面積約3cm2，實驗第0、1天在小鼠腹部均勻涂布0.

5、5％DNFB25μl致敏；實驗第5天于小鼠左耳背部及腹側(cè)均勻涂布0.25％DNFB20μl誘發(fā)皮炎。 2、小鼠分組給藥 加味玉屏風顆粒按國家藥典人體用量的10倍、20倍、40倍配制為低、中、高劑量。將ACD小鼠隨機分為五組，分別為生理鹽水組、陽性對照組及中藥低劑量組、中劑量組和高劑量組。每組10只。實驗第0、1、2日及第5日誘發(fā)前2小時及誘發(fā)后6小時灌服藥液或生理鹽水。陽性對照組用氫化可的松24mg/kg.d。

6、3、小鼠相關(guān)臨床指標的測定 用電子秤準確稱量小鼠實驗前后的體重差；用外徑千分尺測量小鼠雙側(cè)耳中部的厚度；以打孔器取左右耳中部的組織塊稱重，計算左右耳塊的重量差；摘取小鼠脾臟及胸腺，稱重，分別計算脾指數(shù)及胸腺指數(shù)。 4、取小鼠左耳組織塊進行HE染色，鏡下計數(shù)單一核細胞以及多核細胞。 5、NF-κBp50檢測 取小鼠左耳組織塊用免疫組化SP法對角質(zhì)形成細胞中表達的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp50進行免疫組化染色，半

7、定量評分。 6、細胞因子的測定 誘發(fā)24小時后將各組小鼠摘眼球取血，分離血清。用免疫酶聯(lián)吸附ELISA法對小鼠外周血γ干擾素(IFN-γ)、白介素4(IL-4)及腫瘤壞死因子a(TNF-a)的表達進行檢測。 7、臨床觀察 用加味玉屏風顆粒治療20例慢性蕁麻疹患者及20例慢性濕疹患者，觀察其療效、起效時間及復發(fā)率。 8、細胞免疫的檢測 經(jīng)玉屏風顆粒治療的20例濕疹患者，在其療程開始及結(jié)束時分

8、別采取2ml外周血，用流式細胞儀檢測其外周血中T淋巴細胞亞群及NK細胞，并與正常健康人群進行對比。 [結(jié)果] 1、實驗小鼠體重的改變 實驗前各組小鼠在體重方面無明顯差異。而實驗前后的小鼠體重均有不同程度的減輕。其中生理鹽水組體重減輕較為顯著，而服用中藥中、高劑量組體重變化與生理鹽水組相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。并且高劑量組優(yōu)于低劑量組及陽性對照組(P＜0.05)。隨著所服用加味玉屏風顆粒劑量的增高，體重減輕

9、減少。 2、實驗小鼠耳廓腫脹程度的改變 誘發(fā)后各組小鼠左耳均有不同程度的腫脹。中藥各組及氫化可的松組對小鼠的誘發(fā)前后的左耳重量與生理鹽水組比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。并且中、高劑量組優(yōu)于低劑量組(P＜0.05)。耳片厚度的改變中藥組及陽性對照組亦優(yōu)于生理鹽水組，并且中、高劑量組優(yōu)于低劑量組(P＜0.05)，高劑量組與陽性對照組無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。隨著中藥給藥劑量的增高，對小鼠耳片炎癥的抑制作用增強。

10、 3、實驗小鼠胸腺指數(shù)及脾指數(shù)的變化 陽性對照組、中劑量組和高劑量組小鼠胸腺指數(shù)的改變均與生理鹽水組有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；同時低劑量組、中劑量組、高劑量組均與陽性對照組有差異(P＜0.05)；而低劑量組、中劑量組和高劑量組三組之間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。小鼠脾臟指數(shù)的改變顯示陽性對照組與其余各組均有差異(P＜0.05)，而中藥各劑量組與生理鹽水組相比無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。 4、實驗小鼠耳

11、部皮膚組織病理學檢查 在ACD小鼠模型組的病理切片中可以看到有大量的單一核細胞及少數(shù)多核細胞的浸潤，而給予中藥玉屏風顆粒后，局部炎癥細胞的浸潤明顯減少，細胞間水腫減輕，真皮血管的擴張程度亦隨之減輕。通過顯微鏡下計數(shù)顯示，服用中藥組小鼠的單一核細胞的浸潤情況明顯優(yōu)于對照組(P＜0.05)，表現(xiàn)為單一核細胞計數(shù)及多核細胞數(shù)的明顯減少，并且隨著中藥劑量的增加，這一趨勢更為顯著。 5、對實驗小鼠皮膚角質(zhì)形成細胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κ

12、Bp50表達的影響 生理鹽水組小鼠角質(zhì)形成細胞內(nèi)可見多量NF-κBp50的表達，表現(xiàn)為胞漿及部分胞核可見棕黃色顆粒沉著。而氫化可的松組小鼠耳片組織中僅可見散在胞漿表達或無表達，胞核基本未見表達。在中藥治療組中，我們觀察到隨著中藥給藥劑量的增高，NF-κBp50的表達明顯下調(diào)(P＜0.05)，多數(shù)表現(xiàn)為在胞漿的散在表達或無表達，無明顯的核內(nèi)表達，并且表達范圍及強度均低于生理鹽水組(P＜0.05)。 6、對實驗小鼠外周血IF

13、N-γ及IL-4含量的影響 與生理鹽水組相比，中藥各組IFN-γ明顯降低(P＜0.05)，并且中高劑量組與低劑量組亦有明顯差異(P＜0.05)。而陽性對照組及各中藥組與生理鹽水組相比IL-4表達亦降低(P＜0.05)，中藥組組間比較無明顯差異；IFN-γIL-4比值亦隨著中藥劑量的增高，呈現(xiàn)降低的趨勢。通過組間比較發(fā)現(xiàn)，中藥組高劑量組優(yōu)于中低劑量組，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。 7、對實驗小鼠外周TNF-a的影響 中藥組

14、小鼠TNF-a值均較生理鹽水組明顯下降(P＜0.05)。通過兩兩比較顯示，高劑量組與陽性對照組無明顯差異，但優(yōu)于中低劑量組(P＜0.05)。 8、各細胞因子與小鼠耳廓腫脹程度及耳廓重量差的相關(guān)分析 通過相關(guān)分析顯示，小鼠的耳片重量及厚度差均與小鼠的IFN-γ、IL-4、TNF-a呈正相關(guān)(P＜0.05)，并且與IFN-γ及TNF-a相關(guān)尤為密切，相關(guān)系數(shù)分別為0.837、0.775(IFN-γ)及0.713、0.729(

15、TNF-a)。 9、加味玉屏風顆粒治療慢性蕁麻疹及慢性濕疹的療效評價 10、經(jīng)加味玉屏風顆粒治療的慢性濕疹患者外周血細胞免疫的檢測 [結(jié)論] 1、加味玉屏風顆?？捎行е委熍R床上常見的慢性蕁麻疹及慢性濕疹這兩種變態(tài)反應性皮膚病。雖然治療較抗組胺藥物起效慢，但可明顯減少該類疾病的復發(fā)率。其機制與其可調(diào)節(jié)機體的T細胞免疫功能密切相關(guān)。 2、加味玉屏風顆粒可有效抑制實驗小鼠的變應性接觸性皮炎，減輕小鼠皮膚

16、炎性腫脹并可抑制局部單一核細胞及多核細胞的浸潤。 3、加味玉屏風顆?？捎行б种坪宿D(zhuǎn)錄因子NF-κBp50的激活及向核內(nèi)的轉(zhuǎn)移，從而在轉(zhuǎn)錄水平上抑制皮膚炎癥的發(fā)生。 4、加味玉屏風顆?？捎行ё饔糜跈C體的免疫系統(tǒng)，抑制炎癥前細胞因子TNF-a的表達，并調(diào)節(jié)Ⅰ類細胞因子IFN-γ及Ⅱ類細胞因子IL-4之間的平衡。其對于機體細胞因子網(wǎng)絡系統(tǒng)作用，可能為其抗變態(tài)反應的作用靶點及可能機制之一。 [小結(jié)] 本研究將中西

17、醫(yī)理論結(jié)合，在西醫(yī)疾病中引入中醫(yī)衛(wèi)氣營血理論，從全面調(diào)整機體免疫入手，用加味玉屏風顆粒來治療變態(tài)反應性皮膚病，取得了良好的效果。并首次通過現(xiàn)代藥理研究方法對加味玉屏風顆粒治療變態(tài)反應性皮膚病的藥理藥效機制進行了深入研究。研究方法宏觀與微觀相結(jié)合，通過動物實驗、臨床研究及一系列實驗室技術(shù)，既建立動物模型以觀察其宏觀藥效學指標，又通過病理組織學檢查、免疫組化技術(shù)、ELISA技術(shù)、流式細胞儀技術(shù)等多種實驗技術(shù)對加味玉屏風顆?？棺儜B(tài)反應的作用機