氨基糖苷類抗生素對重組印化酶的穩(wěn)定性及耐藥分子機理研究.pdf

1、氨基糖苷類抗生素是臨床治療感染的主要抗菌藥物之一,進入臨床使用已有60多年的歷史,在這個過程中細菌也不斷進化,產(chǎn)生了強大的耐藥機制抵御抗菌藥物的選擇。細菌對氨基糖類抗生素的耐藥機制有四種分別是:(1)產(chǎn)氨基糖苷類修飾酶(AMEs)。包括三個大的家族乙?；?從C)、磷酸化酶(APH)和腺苷化酶(ANT);(2)產(chǎn)16s rRNA甲基化酶;(3)細菌細胞外膜通透性改變;(4)外排泵對藥物的外排作用。其中氨基糖苷類修飾酶和16s rRNA甲

2、基化酶是最主要的耐藥機制。前者修飾氨基糖苷類抗生素側(cè)鏈上的氨基和羥基,后者甲基化修飾氨基糖苷類抗生素的作用靶點16s rRNA,兩種機制都可以有效的阻斷氨基糖苷類抗生素與靶點結(jié)合,從而使其失去抗菌活性。
　　 本論文研究氨基糖苷類抗生素對三類重組氨基糖苷類修飾酶的穩(wěn)定性,研究臨床重要耐藥菌——鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類抗生素耐藥的分子機制,旨在探討基于氨基糖苷類鈍化酶(AMEs)、16s rRNA甲基化酶的氨基糖苷類抗生素耐藥分子

3、機制研究,為氨基糖苷類抗生素的結(jié)構(gòu)改造提供依據(jù),為臨床抗感染治療提供有效藥物。
　　 論文第一部分在前期工作基礎上,應用分子生物學、基因工程技術,獲得三類、6個重組細菌氨基糖苷類修飾酶,建立了氨基糖苷類抗生素分子評價模型和方法,并評價了8個主要的氨基糖苷類抗生素即威替米星(1-N-乙基威大霉素)、威大霉素、奈替米星(1-N-乙基西索米星)、西索霉素、依替米星(1-N-乙基慶大霉素C1a)、慶大霉素、阿米卡星(1-N-氨基-羥丁酰

4、卡那霉素A)、卡那霉素對常見的三類重組氨基糖苷類鈍化酶即乙酰化酶AAC(6')-Ie、AAC(6')Ib、AAC(6')-Ib-cr、磷酸化酶APH(2")-Ia、雙功能修飾酶AAC(6')-Ie-APH(2")-Ia、腺苷化酶ANT(2")-Ia的穩(wěn)定性,比較不同的酶之間的催化活性的差異,以及同一個酶對不同底物,尤其對半合成抗生素與其母體化合物之間的催化活性的差異。
　　 結(jié)果表明,雙功能酶AAC(6')-Ie-APH(2")

5、-Ia乙酰化結(jié)構(gòu)域?qū)Φ孜锏霓D(zhuǎn)化效率最強,kcat/Km值在105～107M-1S-1。乙酰化酶AAC(6')-Ie對底物的轉(zhuǎn)化效率在103～105M-1S-1。AAC(6')-Ib,AAC(6')-Ib-cr,APH(2")-Ia,AAC(6')-Ie-APH(2")-Ia磷酸化結(jié)構(gòu)域和ANT(2")-Ia對底物的轉(zhuǎn)化效率均介于104～105 M-1S-1?？傮w上,8個氨基糖苷類抗生素對重組乙酰化酶、磷酸化酶、腺苷化酶的穩(wěn)定性,以阿米卡

6、星、威替米星最強,其次為奈替米星、依替米星,半合成抗生素威替米星、奈替米星、依替米星、阿米卡星分別高于其母體化合物威大霉素、西索霉素、慶大霉素、卡那霉素。
　　 威替米星對乙酰化酶AAC(6')-Ie的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于其他抗生素優(yōu)勢。比母體化合物威大霉素穩(wěn)定45.8倍,比其它六個藥物穩(wěn)定69.1-250倍。威替米星對雙功能酶AAC(6')-Ie-APH(2")-Ia乙?；Y(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性比母體化合物威大霉素強39.2倍,比其它六個化

7、合物強60.0-116.7倍。威替米星對腺苷化酶ANT(2")-Ia的穩(wěn)定性。也表現(xiàn)出了優(yōu)勢(阿米卡星不與其反應除外),比其它化合物穩(wěn)定1.8—7.5倍。磷酸化酶APH(2")-Ia以及AAC(6')-Ie-APH(2")-Ia的磷酸化結(jié)構(gòu)域?qū)?個藥物的磷酸化作用,以及乙?；窤AC(6')-Ib及AAC(6')-Ib-cr對8個藥物的乙?；饔玫拇呋瘏?shù)在相對較小的范圍內(nèi)波動。
　　 阿米卡星對磷酸化酶APH(2")-Ia,雙

8、功能酶AAC(6')-Ie-APH(2")-Ia磷酸化活性,乙?；窤AC(6')-Ib及AAC(6')-Ib-cr乙?；钚砸约耙约跋佘栈窤NT(2")-Ia腺苷化活性均顯示出了比其它藥物強大的穩(wěn)定性。這可能是因為其結(jié)構(gòu)中2脫氧鏈霉胺環(huán)上的1-N-氨基羥丁酰取代基能顯著影響這些酶與底物的結(jié)合的空間位阻,并降低酶對底物的轉(zhuǎn)化效率。
　　 論文第二部分研究臨床重要耐藥菌——鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類抗生素耐藥的分子機制,考察了13

9、種常見的修飾酶基因型及3種常見的甲基化酶基因型在52株氨基糖苷類抗生素高水平耐藥(慶大霉素、阿米卡星MIC>1024μg/mL)的鮑曼不動桿菌中的分布。
　　 結(jié)果表明,52株高水平耐慶大霉素和阿米卡星的菌株中,乙酰化酶基因是所有修飾酶基因型中檢出率最高的基因,aac(3)-1和aac(6')-Ib的檢出率分別為71.1％(37/52)和57.6％(30/52),腺苷化酶基因ant(2")-Ia和ant(3")-Ia的檢出率次之

10、,分別為53.8％(28/52)和5.7％(3/52),磷酸化酶基因aph(3')-Ⅲa、aph(2")-Ib、aph(2")-Ic、aph(2")-Id、aph(4')-Ia和腺苷化酶基因ant(4')-Ia均未檢出。3個16srRNA甲基化酶基因中,armA基因的檢出率最高,達98％(51/52),rmtB,rmtC基因未檢出。鮑曼不動桿菌中同時檢出三個不同的耐藥基因的概率高達69.2％(36/52)。構(gòu)建基因組文庫篩選攜帶耐藥基因