豬帶絳蟲六鉤蚴45W-4B和TSOL18基因的克隆、表達(dá)及免疫原性分析.pdf

1、收集成熟的豬帶絳蟲蟲卵，經(jīng)孵化和激活后，提取六鉤蚴總RNA。根據(jù)蛋白質(zhì)專家系統(tǒng)對蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果，設(shè)計特異性引物，通過PCR擴(kuò)增截去45W-4B基因的N端信號肽和C端疏水氨基酸序列以提高抗原的穩(wěn)定性和可溶性，克隆出45W-4B和TSOL18基因，分析比較與國外報道的豬帶絳蟲45W-4B和TSOL18相應(yīng)片段的同源性分別為99.7％和99.5％。將基因克隆至原核表達(dá)載體pGEX-4T-1，在大腸桿菌BL21中以GST融合蛋白的形式表達(dá)，

2、SDS-PAGE分析證明：45W-4B表達(dá)產(chǎn)物約為40ku的融合蛋白，主要呈可溶性表達(dá)；TSOL18表達(dá)產(chǎn)物約為42ku的融合蛋白，主要以包涵體形式存在。經(jīng)凝膠掃描、Gel-ProAnalyzer分析，45W-4B表達(dá)量約占菌體蛋白的35％，TSOL18表達(dá)量約占菌體蛋白的25％。Westernblot分析表明可兩種重組抗原能與豬囊尾蚴血清反應(yīng)，說明兩種重組抗原具有良好的免疫反應(yīng)活性。 分別用純化的GST、GST-TSOL18、

3、GST-45W-4B和豬囊蟲全蟲粗制抗原作為抗原，以206為佐劑制成疫苗，對豬進(jìn)行了兩批免疫保護(hù)性試驗。結(jié)果表明，免疫后15d抗體水平開始上升，在首次免疫后50d左右達(dá)到峰值，且至少在免疫后90d內(nèi)保持陽性水平。外周血淋巴細(xì)胞略有增殖，在感染后10d迅速升高。第一次試驗在感染后93d剖檢豬，TSOL18和45W-4B免疫組的減蟲率分別達(dá)94％和95％，與豬囊蟲全蟲粗制抗原免疫組減蟲率為92％的保護(hù)效果相當(dāng)。第二次試驗，抗原保存3個月后進(jìn)