人類骨肉瘤細(xì)胞系與正常成骨細(xì)胞系質(zhì)膜比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文人類骨肉瘤細(xì)胞系與正常成骨細(xì)胞系質(zhì)膜比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究姓名：李健申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：外科學(xué)（骨科）指導(dǎo)教師：蔡鄭東;紀(jì)方20100501人類骨肉瘤細(xì)胞系與正常成骨細(xì)胞系質(zhì)膜比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究中文摘要目的與背景：骨肉瘤由腫瘤性成骨細(xì)胞、骨樣組織組成，為起源于成骨組織的惡性腫瘤，其發(fā)病率在原發(fā)性骨惡性腫瘤中占據(jù)首位。骨肉瘤尤多見于兒童及青少年，因其早期表現(xiàn)隱匿且早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，一直是困擾骨科及腫瘤科醫(yī)師的難題。

2、近些年隨著診斷和治療手段的進(jìn)步，尤其是新輔助化療方法的廣泛開展，骨肉瘤患者的5 年生存率已經(jīng)達(dá)到6 7 ％．7 0 ％；同時(shí)，在新輔助化療的保駕下，骨肉瘤保肢手術(shù)也得以實(shí)施，患者術(shù)后功能得到顯著改善。但仍然不能忽視的是：初診較晚、已存在轉(zhuǎn)移的患者，以及對(duì)化療反應(yīng)不明顯的患者，即便接受大劑量化療，其預(yù)后仍不能令人滿意( 5 年生存率約為2 0 —4 0 ％) 。其癥結(jié)在于：1 ．缺乏可用于骨肉瘤早期診斷的腫瘤標(biāo)志物；2 ．缺乏骨肉瘤治療的

3、特異性靶點(diǎn)。因此，探求新的骨肉瘤標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)，是實(shí)現(xiàn)骨肉瘤的早期診斷和有效治療中的關(guān)鍵。比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得高通量篩檢腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞間差異蛋白質(zhì)成為可能。通過在蛋白質(zhì)水平及腫瘤相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾水平上的差異組學(xué)研究，可能發(fā)現(xiàn)新的有價(jià)值的腫瘤標(biāo)記物及治療靶點(diǎn)。但是，人類骨肉瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究起步較晚且發(fā)展緩慢。據(jù)檢索，僅有為數(shù)不多的文獻(xiàn)對(duì)骨肉瘤組織或細(xì)胞系進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究。由于蛋白質(zhì)組構(gòu)成極為復(fù)雜，低拷貝蛋白質(zhì)及質(zhì)膜

4、蛋白質(zhì)通常很難在全細(xì)胞或全組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究中被檢出。近來，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展更多關(guān)注于亞細(xì)胞組分。在各類亞細(xì)胞組分中，細(xì)胞質(zhì)膜作為細(xì)胞與內(nèi)環(huán)境之間物質(zhì)交流、能量與信息轉(zhuǎn)換的“門戶”或“門鈴”，發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。這一作用的主要執(zhí)行者是質(zhì)膜蛋白質(zhì)。因此有必要對(duì)骨肉瘤細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究。材料和方法：1 細(xì)胞培養(yǎng)和組織準(zhǔn)備1 ．1 細(xì)胞培養(yǎng)：人類骨肉瘤細(xì)胞系M G ．6 3 和正常成骨細(xì)胞系h F O B l ．1

5、9 ( 表達(dá)S V 4 0大T 抗原) 購于美國菌種保藏中心( A m e r i c a n T y p eC u l t u r e C o l l e c t i o n ，M a n a s s a s V A ，U S A ) 。兩種細(xì)胞系均在5 ％C 0 2 ，3 7 。C 的加濕孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含有1 0 ％胎牛血清( F B S ) 的D M E M ( 購自G I B C O 公司) 培養(yǎng)基。M G ．6 3 細(xì)胞

6、每2 到3 天傳代一次，h F O B l ．1 9 每4 到5 天傳代一次。將H a m ‘SF 1 2 培養(yǎng)基與無酚紅的D M E M 按1 ：1混合并加入2 ．5m m o l ／L L ．谷氨酰胺和0 ．3m g ／m L G 4 1 8 ，用以培養(yǎng)h F O B l ．1 9 細(xì)胞。為消除培養(yǎng)差別對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，在質(zhì)膜抽提前4 8 小時(shí)撤去培養(yǎng)基中的G 4 1 8 。每次質(zhì)膜蛋白質(zhì)的提取使用1 0 8 個(gè)細(xì)胞。1 ．2 組織