FAK在不同遷移特性骨肉瘤亞克隆細(xì)胞系的表達(dá)及其意義.pdf

1、本文對FAK在不同遷移特性骨肉瘤亞克隆細(xì)胞系的表達(dá)及其意義進(jìn)行了探討。本研究分為三個部分：
　　 第一部分：背景。腫瘤是一種嚴(yán)重危害人體健康的疾病，尤其是惡性腫瘤，往往是造成患者殘疾、死亡的原因。惡性腫瘤細(xì)胞具有無限增殖的能力，同時還具有向遠(yuǎn)處組織器官轉(zhuǎn)移的能力。惡性腫瘤向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是造成腫瘤患者死亡的重要原因，腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)之間一系列復(fù)雜的、多步驟的、多因素相互作用的動態(tài)過程:首先，腫瘤細(xì)胞

2、從原來腫瘤組織中脫離并向周圍侵襲、遷移;其次，腫瘤細(xì)胞侵入周圍的血管或淋巴管，通過這些管道向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;最后，腫瘤細(xì)胞能在遠(yuǎn)處組織器官中增殖生長。按Liotta等提出的惡性腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的三步驟假說，從分子水平上將這個過程分為:1、粘附;2、降解;3、遷移。骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨骼肌肉系統(tǒng)惡性腫瘤，大約占兒童惡性腫瘤的2.4％，10-20歲為骨肉瘤發(fā)病的高峰期，與其他肉瘤一樣，骨肉瘤主要轉(zhuǎn)移至肺部，由于原發(fā)病灶可以通過手術(shù)切除，因此肺

3、轉(zhuǎn)移是骨肉瘤的主要致死因素。如何抑制骨肉瘤增殖生長，尤其向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，成為臨床治療骨肉瘤的難題。雖然已經(jīng)使用了新輔助化療、抑制腫瘤血管生長和保肢手術(shù)相結(jié)合的方式，總的5年無瘤生存率仍僅有65％。隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中分子路徑多樣性的認(rèn)識，分子靶向治療成為臨床治療腫瘤、提高腫瘤患者生存率的研究熱點。黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是1992年Hansks等在轉(zhuǎn)染的v-src雞胚成纖維細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)并克隆鑒定

4、出來的。FAK是一種非受體絡(luò)氨酸激酶，人的FAK基因定位于人體8q24，cDNA全長4285bp，編碼1028個氨基酸，相對分子質(zhì)量為125kDa，在結(jié)構(gòu)上，F(xiàn)AK包括一個N-氨基端FERM調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域、一個中央催化酶結(jié)構(gòu)域、兩個富含脯氨酸的主鏈及一個羧基端粘著斑結(jié)構(gòu)域。FAK在生物進(jìn)化過程中高度保守，故物種間的同源性高達(dá)90％。FAK廣泛分布于人體內(nèi)各種細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等。FAK可以介導(dǎo)細(xì)胞多條

5、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路廣泛參與細(xì)胞的多種生物學(xué)過程，并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移、血管的生成。FAK在對腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲密切相關(guān)，其可通過介導(dǎo)細(xì)胞信號通路，引起細(xì)胞骨架的變化，從而引起細(xì)胞遷移、侵襲。
　　 雖然諸多實驗證實在許多惡性腫瘤組織（乳腺癌、肺癌、前列腺、肝癌、胰腺癌、大腸癌、胃癌等）中發(fā)現(xiàn)FAK出現(xiàn)高水平的表達(dá)，并對腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用，但是對于其在骨肉瘤中的表達(dá)情況、FAK在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制卻是少有

6、報道。因此FAK的在骨肉瘤中的表達(dá)及設(shè)想通過抑制FAK轉(zhuǎn)錄活性及功能探討其在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的中作用是我們研究的焦點。隨著RNA干擾技術(shù)的發(fā)展，為研究靶向蛋白對腫瘤發(fā)生發(fā)展開辟新的道路，同時為治療腫瘤提供了新的方向。
　　 第二部分：FAK在不同遷移特性骨肉瘤亞克隆細(xì)胞系中的表達(dá)的實驗研究。
　　 目的：探討FAK在不同遷移特性骨肉瘤亞克隆細(xì)胞系中的表達(dá)。
　　 方法：⑴采用有限稀釋法，將骨肉瘤細(xì)胞143B細(xì)胞在9

7、6孔板中稀釋成每孔1個細(xì)胞，鏡下觀察并記錄單克隆孔，加入條件培養(yǎng)基（其中含20％FBS，余下條件同母細(xì)胞系的培養(yǎng)）進(jìn)行培養(yǎng)。37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周。待細(xì)胞增殖達(dá)到每孔面積的1/3時，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)，后再轉(zhuǎn)至6孔板，最后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿培養(yǎng)。⑵采用劃痕實驗鑒定骨肉瘤亞克隆細(xì)胞的遷移能力。用記號筆于12孔板每孔背面與劃痕平行劃5個小圓點，選取生長速度相近的5株亞克隆細(xì)胞系，標(biāo)記為A1、A2、A3、A4、A5接種于

8、做有標(biāo)記的12孔板中，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至90％-100％，在單層細(xì)胞上，用200μl槍頭沿培養(yǎng)板底部做一“1”字型劃痕，PBS洗三次，加入培養(yǎng)基，用激光共聚焦顯微鏡攝像。于每個小圓點附近取劃痕區(qū)距離（A值），繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24小時或劃痕愈合，取相同劃痕區(qū)域遷移后的距離（B值），根據(jù)下面公式計算出細(xì)胞相對遷移距離。相對遷移距離=(A-B)/A。相同時間內(nèi)，相對遷移距離較大的亞克隆細(xì)胞系為遷移能力較強(qiáng)的亞克隆細(xì)胞。實

9、驗重復(fù)三次。⑶Western blotting檢測不同遷移特性骨肉瘤亞克隆細(xì)胞系中FAK的表達(dá)。將分離出不同遷移能力的骨肉瘤亞克隆細(xì)胞系相同細(xì)胞數(shù)接種于6孔板，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合至80％時，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞2次，加入SDS樣品緩沖液，刮除細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到EP管，煮沸樣品5min。離心12000rpm離心5min，取上清。取等量樣品上樣于SDS-PAGE，電泳至溴酚藍(lán)跑到膠底部。轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5％脫

10、脂奶粉4℃過夜封閉，F(xiàn)AK抗體(1∶400)、α-Tubulin抗體(1∶800)4℃孵育過夜。PBS·T洗膜3次，每次10min。二抗室溫孵育2小時，緩慢搖動。PBST洗膜3次，每次10min，加入顯色試劑，顯影，定影，對x光底片掃描，觀測蛋白條帶的亮度來確定蛋白表達(dá)的高低。⑷所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。定量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較根據(jù)各組間方差齊性檢驗結(jié)果選

11、擇不同的方法，按0.05檢驗水準(zhǔn)，若組間方差齊同，則采用LSD-t檢驗，若組間方差不齊，則采用Tamhane's T2檢驗。以P≤0.05認(rèn)為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：骨肉瘤細(xì)胞143B的單克隆化分離96孔板中成功分離單細(xì)胞生長的約為20個，其中14個克隆成功傳至培養(yǎng)皿中繼續(xù)生長，余下皆發(fā)生凋亡或無法繼續(xù)傳代，在同等培養(yǎng)情況下，傳至8-12代后，14株亞克隆細(xì)胞中又有2株單克隆細(xì)胞亞系出現(xiàn)自發(fā)性的死亡，而無法繼續(xù)傳代。挑選

12、生長速度相近的5株亞克隆細(xì)胞系(A1、A2、A3、A4、A5)。通過劃痕實驗發(fā)現(xiàn)骨肉瘤亞克隆細(xì)胞系A(chǔ)1、A2、A3、A4、A5的相對遷移距離分別為0.458±0.019、0.931±0.010、0.941±0.014、0.617±0.015、0.701±0.018。骨肉瘤亞克隆細(xì)胞系A(chǔ)2、A3遷移能力較A1強(qiáng)(P＜0.05)，而其細(xì)胞中FAK的表達(dá)亦明顯高于其他亞克隆細(xì)胞系。
　　 結(jié)論：FAK在遷移能力較強(qiáng)的骨肉瘤亞克隆細(xì)胞系

13、中高表達(dá)。
　　 第三部分：FAK對骨肉瘤細(xì)胞亞克隆細(xì)胞系的增殖及遷移作用的實驗研究。
　　 目的：探討FAK對骨肉瘤細(xì)胞亞克隆細(xì)胞系的增殖及遷移作用。
　　 方法：⑴將骨肉瘤亞克隆細(xì)胞系接種于6孔板中，接種細(xì)胞數(shù)量以24小時內(nèi)融合至40％-60％為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)立陰性對照組及FAK siRNA組，其中陰性對照組中加入50nM/L陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，F(xiàn)AK siRNA組加入30 nM/L、50nM/L、60 n

14、M/L濃度的FAK siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染操作按LipofectAMINE2000試劑說明書進(jìn)行。37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時后換液，繼續(xù)培養(yǎng)至48小時后進(jìn)行轉(zhuǎn)染水平檢測。⑵Western blotting檢測小干擾RNA轉(zhuǎn)染水平。分別用50nM/L陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，F(xiàn)AK siRNA組加入30 nM/L、50nM/L、60 nM/L濃度的FAK siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞2次，

15、加入SDS樣品緩沖液，刮除細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到EP管，煮沸樣品5min。離心12000rpm離心5min，取上清。取等量樣品上樣于SDS-PAGE，電泳至溴酚藍(lán)跑到膠底部。轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5％脫脂奶粉4℃過夜封閉，F(xiàn)AK抗體(1∶400)、α-Tubulin抗體(1∶800)4℃孵育過夜。PBS·T洗膜3次，每次10min。二抗室溫孵育2小時，緩慢搖動。PBS·T洗膜3次，每次10min，加入顯色試劑，顯影，定影，對x光底片掃描，觀測蛋白條帶

16、來確定蛋白表達(dá)的高低。⑶設(shè)立空白對照組、陰性對照組、FAK siRNA組，分別加入50nM/L濃度的轉(zhuǎn)染試劑、陰性對照siRNA、FAK siRNA轉(zhuǎn)染遷移能力較強(qiáng)的亞克隆細(xì)胞系48小時。將經(jīng)過轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞按1×104個/孔接種于24孔。37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時后，胰酶消化，每組每天計數(shù)3個小孔，連續(xù)計數(shù)4天。描繪各組細(xì)胞生長曲線。⑷設(shè)立陰性對照組、FAK siRNA組分別加入50nM/L濃度的陰性對照siRNA、

17、FAK siRNA轉(zhuǎn)染遷移能力較強(qiáng)的亞克隆細(xì)胞系48小時。將經(jīng)過轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞接種于做有標(biāo)記（每孔背面與劃痕平行劃5個小圓點）的12孔板中，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至90％-100％，在單層細(xì)胞上，用200μl槍頭沿培養(yǎng)板底部成“1”字形劃痕，PBS洗三次，加入培養(yǎng)基，用激光共聚焦顯微鏡攝像。于每個小圓點附近取劃痕區(qū)距離（A值），繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24小時或劃痕愈合，取相同劃痕區(qū)域遷移后的距離（B值），根據(jù)下面公式計算出細(xì)

18、胞相對遷移距離。相對遷移距離=(A-B)/A。相同時間內(nèi)，相對遷移距離較大的亞克隆細(xì)胞系為遷移能力較強(qiáng)的亞克隆細(xì)胞。實驗重復(fù)三次。⑸實驗設(shè)立陰性對照組、FAK siRNA組，分別加入50nM/L濃度的陰性對照siRNA、FAK siRNA轉(zhuǎn)染遷移能力較強(qiáng)的亞克隆細(xì)胞系48小時。將經(jīng)過轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞爬片生長8小時后，2％ PFA室溫15分鐘固定細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞3次，每次5分鐘。加FITC-phaloidin(1∶500)、DAPI(

19、1∶500)室溫下給細(xì)胞染色60分鐘。PBS·T清洗細(xì)胞3次，每次5分鐘。加抗熒光淬滅封片液封片。共聚焦顯微鏡下觀察、攝像。取5-10個不同視野，細(xì)胞總數(shù)不少于200，計算形成板狀偽足的細(xì)胞個數(shù)，計算占總數(shù)的比例。⑹所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。定量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。按0.05檢驗水準(zhǔn)，采用兩樣本t檢驗、x2檢驗進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P≤0.05認(rèn)為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：通過生長曲線發(fā)

20、現(xiàn)FAK表達(dá)下調(diào)前后骨肉瘤亞克隆細(xì)胞系A(chǔ)3生長趨勢無明顯變化，而當(dāng)對FAK“敲除”后，F(xiàn)AK siRNA組的細(xì)胞相對遷移距離為0.322±0.01，較陰性對照siRNA組（0.942±0.025）明顯降低(P＜0.05)。同時，F(xiàn)AK-siRNA組中細(xì)胞形成板狀偽足細(xì)胞數(shù)量的比例為12.8％，與陰性對照組相比(33.3％)，明顯減少(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：①FAK對骨肉瘤細(xì)胞的增殖無明顯作用；②FAK可能通過影響板狀偽足