下調(diào)P2X-,4-表達對永生化小鼠小膠質(zhì)細胞活化的影響.pdf

1、目的：神經(jīng)損傷后神經(jīng)末梢和受損的細胞釋放大量的ATP，ATP激活脊髓小膠質(zhì)細胞膜上P2X4受體，促使小膠質(zhì)細胞釋放大量炎性介質(zhì)，如IL-1，IL-6，TNF等，是神經(jīng)病理性痛發(fā)生的主要機制之一。P2X4受體作為信號轉(zhuǎn)導通路中的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，日益受到研究關(guān)注。目前研究已證實向正常大鼠鞘內(nèi)注入P2X4受體已被激活的小膠質(zhì)細胞可引發(fā)異常疼痛，而注入P2X4受體基因的反義寡核苷酸片段能減輕此種疼痛。本實驗篩選永生化小鼠小膠質(zhì)細胞特異性P2X4s

2、iRNA，并將其轉(zhuǎn)染至永生化小鼠小膠質(zhì)細胞，鑒定其表達，并探討下調(diào)P2X4對永生化小鼠小膠質(zhì)細胞活化的影響。
　　 方法：
　　 1.特異性P2X4siRNA的篩選及鑒定轉(zhuǎn)染FAM-siRNA 16 h后，激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測永生化小鼠小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)染效率；設計3條特異性siRNA經(jīng)lipofectamine 2000介導轉(zhuǎn)染永生化小鼠小膠質(zhì)細胞，72 h后半定量RT-PCR觀察干擾前后P2X4基因mRN

3、A水平表達，比較對應不同位點的三對siRNA片段對P2X4基因的干擾效果，分析RNA干擾的特異性，從中篩選出特異性最高的一條siRNA；轉(zhuǎn)染該序列72 h后Western blot檢測P2X4的表達。
　　 2.下調(diào)P2X4基因表達對永生化小鼠小膠質(zhì)細胞活化的影響體外培養(yǎng)永生化小鼠小膠質(zhì)細胞，隨機分為3組：空白對照組、陰性對照組、轉(zhuǎn)染siRNA-F1組。空白對照組未進行任何干預，陰性對照組轉(zhuǎn)染N control siRNA，轉(zhuǎn)

4、染siRNA-F1組轉(zhuǎn)染先前篩選出來的1條特異性siRNA。72 h后，用50 μM ATP刺激，采用LSCM檢測胞內(nèi)鈣離子濃度(intracellular calcium concentration，[Ca2+]I)，P2X4R/OX42免疫熒光雙標染色觀察細胞形態(tài)。
　　 結(jié)果：
　　 1.激光掃描共聚焦顯微鏡顯示轉(zhuǎn)染效率達80[％]；三對siRNA片段中siRNA-F1的沉默效率最高，最大干擾效率達72.2％；We

5、stern blot顯示轉(zhuǎn)染siRNA-F1后P2X4蛋白表達下調(diào)。
　　 2.轉(zhuǎn)染siRNA-F1組ATP活化小膠質(zhì)細胞后，胞內(nèi)鈣離子釋放較陰性對照組和空白對照組減少；P2X4R/OX42免疫熒光雙標染色顯示轉(zhuǎn)染siRNA-F1組細胞存在活化態(tài)小膠質(zhì)細胞和靜息態(tài)小膠質(zhì)細胞，而空白對照組和陰性對照組只存在活化態(tài)小膠質(zhì)細胞。
　　 結(jié)論：
　　 成功篩選出一條特異性 P2X4siRNA—siRNA-F1，能夠下調(diào)永