單鏈抗體融合人血清白蛋白的制備及對重癥肌無力患者血清的抑制作用.pdf

1、重癥肌無力（MG）是累及神經(jīng)肌肉接頭處的某些成分而導(dǎo)致突觸后膜信號傳導(dǎo)障礙的一種自身免疫病，以反復(fù)出現(xiàn)的肌肉收縮無力，用力時惡化，休息后緩解為特征。在80％~85%的MG患者中，其主要的靶抗原是肌肉的乙酰膽堿受體（AChR）。單鏈抗體（scFv）是由免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）經(jīng)一條柔軟可彎曲的肽鏈連接而成。scFv完整的保留了抗原結(jié)合的能力，由于它沒有抗體的Fc段，因此不能激活補體。然而，scFv小分子的生理特點

2、決定了它可以從體內(nèi)經(jīng)腎臟快速清除。scFv637是MG抗原特異性scFv，由人AChRα亞單位上67~76位氨基酸（即主要免疫原區(qū)，MIR）組成。它可以結(jié)合MG患者血清中的抗MIR的自身抗體，從而保護(hù)人AChR，這使它有可能成為一種MG特異性免疫抑制治療劑。與scFv一樣，scFv637具有快速從血液中清除的缺點。因此，在本項研究中，我們將scFv637基因與半壽期較長的人血漿白蛋白（HSA）基因連接，以延長scFv637的半壽期，增加

3、其在血中的穩(wěn)定性。這使得scFv有可能成為MG的一種特異性免疫抑制劑。
　　目的：制備單鏈抗體融合人血清白蛋白，以延長單鏈抗體的半壽期并增加其在血中的穩(wěn)定性，為重癥肌無力的免疫治療奠定基礎(chǔ)。
　　方法：將scFv637與HSA基因連接后轉(zhuǎn)入畢赤酵母菌（Pichia pastoris）中表達(dá)出融合蛋白 scFv637-HSA。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡試驗確定其分子量；通過免疫熒光試驗檢測融合蛋白 scF

4、v637-HSA與人肋間肌AChR的結(jié)合情況；經(jīng)競爭性ELISA檢測融合蛋白抑制MG患者血清中的自身抗體與AChR的結(jié)合能力，以及融合蛋白在健康血清中的穩(wěn)定性。
　　結(jié)果：融合蛋白在畢赤酵母菌中成功表達(dá)，其分子量約為89 kD；免疫熒光試驗結(jié)果顯示，融合蛋白可以與人肋間肌神經(jīng)肌肉接頭處的AChR結(jié)合；經(jīng)12例MG患者血清檢測發(fā)現(xiàn)，融合蛋白對AChR的抑制率為2%~77.4%；融合蛋白在靜態(tài)健康血清中可以維持大約3天。
　　結(jié)