嗜熱菌糖苷酶基因牛乳腺特異表達(dá)載體的構(gòu)建及脂質(zhì)體介導(dǎo)其轉(zhuǎn)染細(xì)胞的研究.pdf

1、利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的生物活性蛋白已成為當(dāng)前生物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，制備乳腺生物反應(yīng)器的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是構(gòu)建高效、特異的表達(dá)載體，而β-乳球蛋白(BLG)是反芻動(dòng)物乳中主要的乳清蛋白。本研究以牛β-乳球蛋白基因上游調(diào)控成分作為啟動(dòng)子，嗜熱菌糖苷酶基因lacS為目的基因，構(gòu)建了lacS基因乳腺特異表達(dá)載體，并通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的牛胎兒成纖維細(xì)胞(bFF)，借助新霉素抗性基因(Neo)和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因(EGFP)來(lái)篩

2、選、純化陽(yáng)性克隆細(xì)胞，為利用核移植技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供細(xì)胞來(lái)源。研究結(jié)果如下： 首先，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出0.92kb牛β-乳球蛋白基因5'端調(diào)控序列和1.49kb嗜熱菌糖苷酶基因編碼序列。并將上述序列與pIRES2-EGFP載體及pUC19載體經(jīng)基因重組構(gòu)建了乳腺特異表達(dá)載體pBLI。使牛β-乳球蛋白基因5'端調(diào)控序列啟動(dòng)嗜熱菌糖苷酶基因在乳腺中特異表達(dá)，而新霉素抗性基因和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因作為標(biāo)記基因在人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)

3、子指導(dǎo)下非組織特異性表達(dá)。 其次，應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法從妊娠2～3月的牛胎兒耳部皮膚中分離純化成纖維細(xì)胞。對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生長(zhǎng)曲線測(cè)定、S4基因性別檢測(cè)和G418敏感濃度的測(cè)定。結(jié)果表明，培養(yǎng)的細(xì)胞具有正常形態(tài)和生長(zhǎng)特性，其供體牛為雌性，G418篩選濃度為800μg/ml，維持濃度為300μg/ml。 最后，以線性化的乳腺特異表達(dá)載體pBLI為外源基因，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞。通過(guò)比較不同DNA劑量