FLT3-L-GM-CSF對DC細(xì)胞的體外刺激以及DC-CIK體外培養(yǎng)方法的研究.pdf

1、目的：隨著細(xì)胞免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞免疫治療已在臨床實驗中開展，并取得一定的療效。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer cells，簡稱CIK)作為一種新型免疫活性細(xì)胞，已經(jīng)用于多種惡性腫瘤的過繼免疫治療中。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，簡稱DC)是迄今發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗原提呈細(xì)胞(APC)，它通過處理、提呈抗原而介導(dǎo)機體免疫反應(yīng)。由于很多腫瘤宿主缺乏功能性DC而不能誘發(fā)抗原特異性

2、T細(xì)胞免疫應(yīng)答，故如何在體外誘導(dǎo)功能性DC用于主動免疫治療，具有重要臨床意義。研究報道，F(xiàn)LT3配體(FLT3-L)作為一種細(xì)胞因子，可以成功誘導(dǎo)成熟DC的生長，并且誘導(dǎo)漿細(xì)胞樣DC的生長，增加DC的數(shù)量，增強DC的特異性。作為經(jīng)典的DC誘導(dǎo)刺激因子，GM-CSF在DC培養(yǎng)中的作用已得到肯定。本研究旨在探討相同劑量的FLT3-L和GM-CSF在誘導(dǎo)成熟DC的體外培養(yǎng)過程中的作用，以及不同的DC-CIK共培養(yǎng)方式誘導(dǎo)的成熟CIK的特異性免

3、疫表型表達(dá)以及對腫瘤細(xì)胞殺傷活性的差異，從而為臨床DC-CIK治療提供參考。 方法： 實驗的第一部分：細(xì)胞取自正常人外周血單個核細(xì)胞。使用FLT3-L誘導(dǎo)DC成熟組作為實驗組，GM-CSF誘導(dǎo)DC成熟組作為對照組，分離外周血貼壁細(xì)胞培養(yǎng)DC，隔日添加細(xì)胞因子，并按計劃分別于培養(yǎng)過程中行流式細(xì)胞學(xué)檢查分析不同的細(xì)胞因子誘導(dǎo)DC的免疫表型的差異。 實驗的第二部分：細(xì)胞來源有兩種：EBV感染所致的噬血細(xì)胞綜合癥患者的外

4、周血單個核細(xì)胞、AML-M4緩解期患者的外周血單個核細(xì)胞。EBV感染噬血細(xì)胞綜合癥患者DC培養(yǎng)過程中加入EBV抗原肽后與CIK共培養(yǎng)，比較是否可以培養(yǎng)出克隆性增強的CIK，從而提高CIK的抗瘤活性。AML-M4緩解期患者分別使用FLT3-L/GM-CSF兩種細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)成熟DC，同時培養(yǎng)CIK細(xì)胞，待DC培養(yǎng)成熟后加入CIK，進(jìn)行DC-CIK共培養(yǎng)。培養(yǎng)前后DC分別進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)、行流式細(xì)胞學(xué)檢查；培養(yǎng)前后CIK分別進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)、流式

5、細(xì)胞學(xué)檢查、基因掃描圖譜分析、殺傷實驗。通過一系列的實驗分析，選擇DC-CIK的最佳培養(yǎng)方案。 結(jié)論： 1.通過實驗摸索，我們用縮短培養(yǎng)時間的14天DC-CIK共培養(yǎng)方法，成功培養(yǎng)出樹突狀細(xì)胞和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，建立并優(yōu)化了DC-CIK的培養(yǎng)體系。 2.對EB病毒感染相關(guān)性噬血細(xì)胞綜合征患者進(jìn)行CIK治療是可行的，可以作為臨床輔助治療方式，在DC的培養(yǎng)過程中加入EB病毒相關(guān)的抗原肽可以刺激T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生克隆