單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂在骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化中的作用.pdf

1、目的：近年來研究表明骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)可以體外誘導分化為神經(jīng)細胞，因此BMSCs有望成為神經(jīng)細胞移植的種子細胞來治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，但BMSCs定向誘導分化率低，且分化后的細胞存活時間短而不能有效增殖以滿足移植的需要。如何能夠找到穩(wěn)定高效的誘導方法及提高誘導后神經(jīng)細胞的存活率是需要解決的一個關(guān)鍵問題。單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(monosialotetrahexosyl gan

2、glioside，GM1)在神經(jīng)細胞的發(fā)育、分化、修復和信號轉(zhuǎn)導中有相當重要的作用。研究表明，GM1有誘導BMSCs分化為神經(jīng)元樣細胞的作用，本文就不同濃度GM1對BMSCs的誘導分化作用作一探討。 方法：以全骨髓培養(yǎng)法分離成人BMSCs，進行原代和傳代培養(yǎng)。用流式細胞儀檢測BMSCs表面CD44，CD45，CD90，CD105的表達以鑒定純度。以含有10μg/ml、60μg/ml、90μg/ml GM1的DMEM無血清培養(yǎng)基誘

3、導第五代的BMSCs，陰性對照組不加任何誘導劑。至誘導后7d觀察細胞形態(tài)變化并計數(shù)，誘導后6h以免疫細胞化學法測定各組細胞神經(jīng)細胞特異性表面標志神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)元特異性微管相關(guān)蛋白(MAP-2)，以鑒定是否誘導為神經(jīng)元樣細胞并計算分化百分率。各組間分化百分率進行比較和統(tǒng)計學處理。并用MTT法測定誘導后0.5h、6h、24h、3d細胞生長狀況。 結(jié)果：細胞接種2天后給予PBS沖洗，全量換液可見貼壁細胞呈集落狀生

4、長。8～10天后細胞可基本鋪滿瓶底，為均一梭狀細胞。以1：3比例傳代，傳代后1天左右細胞可以恢復活力并貼壁生長，5～6天后可鋪滿瓶底。傳代至4～5代時細胞形態(tài)比較均一，混雜細胞較少。流式細胞術(shù)檢測細胞表面標志CD44(+)，CD90(+)，CD105(+)，CD45(—)，基本證實BMSCs的純度。BMSCs經(jīng)預(yù)誘導后，細胞體積增大，形態(tài)變長。加入誘導液30～40 min后，細胞開始發(fā)生形態(tài)變化，胞體向內(nèi)收縮，呈球形或圓形，并向周圍長出

5、突起，有立體感，折光性增強；誘導4 h后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，胞體進一步收縮形成突起，胞體立體感增強，周圍出現(xiàn)光暈，可見到很多雙極和多極細胞；6 h后大多數(shù)細胞形成錐形、三角形等不規(guī)則形狀，突起增多變長，細胞間突起相互連接，交錯成網(wǎng)，呈現(xiàn)典型的神經(jīng)細胞樣形態(tài)。到誘導后3天，神經(jīng)元樣細胞增多不明顯。5天后有少量細胞懸浮死亡，突起延長多交織成網(wǎng)狀；7天時細胞形態(tài)與5天時基本相同，但懸浮死亡細胞較多。陰性對照組細胞仍呈均一長梭狀細胞，但細胞

6、生長速度明顯減慢。細胞誘導6 h免疫細胞化學檢測不同濃度GM1組和陰性對照組細胞均有MAP-2，NSE表達，但未檢測到GFAP的表達。10μg/ml、60μg/ml、90μg/ml GM1組NSE、MAP-2細胞陽性率均較陰性對照組明顯高(P＜0.05)。組間比較：60μg/ml、90μg/ml組NSE、MAP-2細胞陽性率均較10μg/ml組高(P＜0.05)，60μg/ml、90μg/ml組細胞陽性率差異不顯著(P＞0.05)。MT