團(tuán)頭魴野生群體、馴養(yǎng)群體、遺傳改良群體的遺傳變異.pdf

1、團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）是草食性魚類，自然分布局限于長江中、下游的一些大、中型湖泊中。自上世紀(jì)50年代在湖北省淤泥湖、梁子湖等被發(fā)掘?yàn)轲B(yǎng)殖對象以來，由于肉質(zhì)好和草食性等優(yōu)點(diǎn)，推廣到全國的許多地方進(jìn)行養(yǎng)殖，已成為中國主要淡水養(yǎng)殖品種之一。長期以來，由于過度捕撈、水域污染、水利工程建設(shè)等原因，團(tuán)頭魴的天然資源已遭嚴(yán)重破壞并趨衰竭。但在另一方面，團(tuán)頭魴人工繁殖技術(shù)的突破，雖極大地促進(jìn)了團(tuán)頭魴養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，但也

2、從此帶來了對天然基因庫的干擾。團(tuán)頭魴經(jīng)過18年選育，才產(chǎn)生了一個優(yōu)良品系——“浦江1號”，在“浦江1號”基礎(chǔ)上，通過人工誘導(dǎo)又獲得了多倍體群體，這些遺傳改良群體的遺傳變異程度以及從天然群體到遺傳改良群體和人工繁殖群體遺傳多樣性的變化趨勢和規(guī)律，都是值得關(guān)注的新課題。因此，從遺傳多樣性的角度，開展團(tuán)頭魴的遺傳資源的調(diào)查和研究已成當(dāng)務(wù)之急。本研究分別采用微衛(wèi)星標(biāo)記和線粒體DNA標(biāo)記技術(shù)對我國團(tuán)頭魴自然分布區(qū)的4個野生群體、2個代表性馴養(yǎng)群體

3、、3個選育良種后期世代群體(“浦江1號”選育系F7，F(xiàn)8，F(xiàn)9)、1個選育奠基群體(F0)以及人工多倍體群體（團(tuán)頭魴同源四倍體、倍間正交三倍體、倍間反交三倍體和倍間異源三倍體）的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了較為深入的比較研究，探討了從野生群體到馴養(yǎng)群體以及遺傳改良群體遺傳多樣性的變化趨勢。主要研究結(jié)果如下:
　　1.團(tuán)頭魴微衛(wèi)星標(biāo)記的分離
　　本研究旨在為團(tuán)頭魴遺傳變異的檢測以及遺傳圖譜的構(gòu)建等奠定技術(shù)基礎(chǔ)。采用5'錨定PCR技術(shù)開發(fā)團(tuán)頭

4、魴基因組微衛(wèi)星資源。以團(tuán)頭魴基因組DNA為材料，設(shè)計9條5'錨定引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增富集微衛(wèi)星序列，將產(chǎn)物連接入pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞后，從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取白斑，PCR法驗(yàn)證為陽性克隆后，選取含有不同長度插入片段的陽性克隆，送生物公司測序。結(jié)果表明，①共獲得450個菌，經(jīng)菌液PCR檢測后得到219個陽性克隆，對這219個陽性克隆進(jìn)行測序，共獲得522個特異微衛(wèi)星位點(diǎn)，其中包括442個二核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)，4個三

5、核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)，以及76個四核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)。②微衛(wèi)星重復(fù)單元包括AG/TC，TG/AC，TA/AT，TGA，CAT，GAT，GAGT和GATA，其中以AG/TC和TG/AC為單位的重復(fù)序列占了絕大多數(shù)，分別為326個(62.45％)和136個(26.05％)。③重復(fù)次數(shù)主要集中在5～10次，占66.67％，最高重復(fù)數(shù)為28次。其中，兩端型重復(fù)類型的微衛(wèi)星有356個(68.20％)，居間型重復(fù)類型的微衛(wèi)星有166個(31.

6、80％)。在單一型標(biāo)記中，完美型占91.19％，非完美型為5.75％，復(fù)合完美型標(biāo)記占3.07％。④選取重復(fù)次數(shù)大于12次的居間型微衛(wèi)星序列用于引物設(shè)計，共設(shè)計58對引物用來進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有25對能擴(kuò)增出特異條帶，其中10對具有多態(tài)性。⑤將開發(fā)的10個多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用于兩個團(tuán)頭魴群體的擴(kuò)增結(jié)果顯示，梁子湖野生群體和選育良種“浦江1號”F7群體中各位點(diǎn)等位基因數(shù)分別為3～17（平均值為8.00）和3～13（平均值為6.50）;期望雜

7、合度分別為0.5786～0.9556（平均值為0.7923）和0.4899～0.9355（平均值為0.7222）。表明這10個微衛(wèi)星標(biāo)記適合作為檢測團(tuán)頭魴群體遺傳變異的分子標(biāo)記。
　　2.團(tuán)頭魴野生群體、馴養(yǎng)群體、選育群體遺傳變異的微衛(wèi)星分析
　　以團(tuán)頭魴的4個野生群體[分別采自梁子湖(LZ)、淤泥湖(YN)、石首(SS)和監(jiān)利（JL）]、2個馴養(yǎng)群體[分別采自湖北公安(GA)和天津換新(HX)]、以及1個選育良種“浦江1號

8、”F7群體(PJ)，采用17個微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行了群體遺傳多樣性與遺傳分化研究。結(jié)果表明，①7個群體的平均等位基因數(shù)（A）為4.88～7.65，平均有效等位基因數(shù)（Ne）為3.20～5.33，平均觀測雜合度(Ho)為0.6985～0.9044，平均期望雜合度（He）為0.6501～0.7805;平均多態(tài)信息含量（PIC）為0.5706～0.7226;群體間遺傳分化指數(shù)(FST)范圍為0.0307～0.1451;群體間Nei標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(Dn

9、)為0.0938～0.4524。②在He方面，4個野生群體間差異不顯著（P＞0.05），2個馴養(yǎng)群體均顯著地(P＜0.05)低于3個野生群體，但與一個野生群體差異不顯著(P＞0.05);2個馴養(yǎng)群體間差異不顯著（P=0.792），“浦江1號”群體低于4個野生群體，高于2個馴養(yǎng)群體。③在FST值方面，4個野生群體間差異不顯著（P＞0.05），2個馴養(yǎng)群體之間、以及它們與“浦江1號”群體間FST值差異均達(dá)到顯著性水平(P＜0.05)。④研究

10、結(jié)果揭示經(jīng)歷7代科學(xué)選育后，團(tuán)頭魴選育群體的雜合度比野生群體有所降低，但相對于其它馴養(yǎng)群體仍保留了較高的遺傳多樣性。從野生群體到馴養(yǎng)群體或到選育群體的遺傳變異和分化，可為魚類種質(zhì)資源的保護(hù)和利用提供重要的判據(jù)。
　　3.團(tuán)頭魴野生群體、馴養(yǎng)群體、選育群體遺傳變異的線粒體DNA分析
　　通過對線粒體DNA控制區(qū)和COⅡ基因序列的聯(lián)合分析，進(jìn)一步研究了團(tuán)頭魴的4個野生群體、2個馴養(yǎng)群體和1個選育良種“浦江1號”F7群體的遺傳多樣

11、性和遺傳分化關(guān)系。結(jié)果表明:①在所分析的1509bp片段中，4種核苷酸(T、C、A、G)的平均含量分別為29.0％、24.1％、31.7％和15.2％。②核苷酸變異類型有轉(zhuǎn)換、顛換、插入/缺失4種。確定了64種單倍型，群體間無共享單倍型。③4個野生群體內(nèi)線粒體DNA的單倍型多樣度(H)在0.857～0.943之間，核苷酸變異位點(diǎn)數(shù)在31～40之間，核苷酸多樣性指數(shù)（π）在0.275％～0.461％間，平均核苷酸差異數(shù)(K)的范圍為4.0

12、43～6.800，線粒體DNA核苷酸序列間的平均遺傳距離在0.0028～0.0046之間;2個馴養(yǎng)群體的相應(yīng)參數(shù)變化范圍分別為0.714～0.800,18～21,0.122％～0.175％,1.800～2.586,0.0012～0.0018,均低于野生群體;選育群體的相應(yīng)參數(shù)分別為0.843，23，0.193％，2.843，0.0019，低于四個野生群體，但高于2個馴養(yǎng)群體。以上5種多樣性參數(shù)在7個群體中的變化趨勢一致，即LZ＞SS＞J

13、L＞YN＞PJ＞HX＞GA。④七群體之間的平均遺傳距離在0.0006～0.0035之間，遺傳分化指數(shù)(Fst)在0.0109～0.1331之間。4個野生群體間Fst值差異不顯著(P＞0.05)，而2個馴養(yǎng)群體間Fst值差異顯著(P＜0.05)，它們與選育群體間的Fst值差異也顯著(P＜0.05)。⑤用UPGMA法和NJ法構(gòu)建的7個團(tuán)頭魴群體的聚類樹基本一致，聚類結(jié)果顯示，七群體團(tuán)頭魴明顯分成兩大支。4個野生群體與公安馴養(yǎng)群體聚為一個大支

14、，“浦江1號”F7群體與換新馴養(yǎng)群體(HX)聚為另一支。
　　4.團(tuán)頭魴“浦江1號”選育后期世代群體同野生群體間遺傳變異的微衛(wèi)星分析
　　以團(tuán)頭魴人工選育良種群體（“浦江1號”選育系F7、F8、F9，3個）為實(shí)驗(yàn)組，野生群體（梁子湖和淤泥湖，共2個）以及選育奠基群體（F0，1個）為對照組，用17個微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行了群體遺傳多樣性與遺傳分化研究。結(jié)果表明，①6個群體的平均等位基因數(shù)（A）為5.71～7.65，平均有效等位基因數(shù)(

15、Ne)為3.79～5.33，平均觀測雜合度(Ho)為0.8170～0.8603，平均期望雜合度（He）為0.7126～0.7805;平均多態(tài)信息含量（PIC）為0.6188～0.7226;群體間遺傳分化指數(shù)（FST）范圍為0.0312～0.1229;群體間Nei標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離（Dn）為0.0928～0.3694。②在He方面，從高到低依次為，梁子湖野生群體、淤泥湖野生群體、選育奠基群體、選育系F7、選育系F8和選育系F9，2個野生群體間差

16、異不顯著(P=0.072)，3個選育群體間差異也不顯著(P＞0.05);3個選育群體顯著(P＜0.05)低于梁子湖(LZ)野生群體;選育奠基群體(F0)與2個野生群體間差異均不顯著(P＞0.05)。③在FST值方面，2個野生群體間FST值差異不顯著（P＞0.05），3個選育群體間FST值差異也不顯著（P＞0.05），但它們與野生群體及奠基群體間的FST值差異顯著(P＜0.05)，奠基群體與2個野生群體間差異不顯著(P＞0.05)。④基于

17、Dn值構(gòu)建的6個群體NJ和UPGMA聚類圖基本一致，6群體分為明顯的兩大組，野生群體（LZ和YN）和奠基群體聚為一組，不同選育后期世代群體（F7，F(xiàn)8和F9）聚為另一組。⑤研究結(jié)果揭示，經(jīng)歷20多年的9代系統(tǒng)選育后，相對于野生群體，團(tuán)頭魴“浦江1號”良種已產(chǎn)生了明顯的遺傳分化，性狀已相當(dāng)穩(wěn)定，但離選育極限尚有一定距離。
　　5.團(tuán)頭魴“浦江1號”選育后期世代群體同野生群體間遺傳變異的線粒體DNA分析
　　通過對線粒體DNA控

18、制區(qū)和COⅡ基因序列的聯(lián)合分析，進(jìn)一步研究了團(tuán)頭魴人工選育良種群體、野生群體及選育奠基群體的遺傳多樣性和遺傳分化關(guān)系。結(jié)果表明:①在所分析的1509bp片段中，4種核苷酸(T、C、A、G)的平均含量分別為29.0％、24.1％、31.7％和15.2％。②核苷酸變異類型有轉(zhuǎn)換、顛換、插入/缺失4種。確定了38種單倍型(haplotype)，2個野生群體間無共享單倍型，它們與奠基群體及3個選育群體間也無共享單倍型。共享單倍型產(chǎn)生在3個選育群

19、體間，F(xiàn)7、F8及F9三群體間有7個共享單倍型。③2個野生群體內(nèi)線粒體DNA的單倍型多樣度（H）在0.857～0.943之間，核苷酸變異位點(diǎn)數(shù)在31～40之間，核苷酸多樣性指數(shù)（π）在0.275％～0.461％間，平均核苷酸差異數(shù)(K)的范圍為4.043～6.800;3個選育群體的相應(yīng)參數(shù)變化范圍分別為0.809～0.843，21～23，0.179％～0.193％，2.621～2.843，均低于野生群體;選育奠基群體的相應(yīng)參數(shù)分別為0.

20、852，30，0.258％，3.982，低于2個野生群體，但高于3個選育群體。以上4種多樣性參數(shù)在6個群體中的變化趨勢一致，即LZ＞YN＞F0＞F7＞F8＞F9。④六群體之間的平均遺傳距離在0.0008～0.0032之間，遺傳分化指數(shù)(Fst)在0.0213～0.1028之間。2個野生群體間Fst值差異不顯著（P=0.0693），3個選育群體間Fst值差異也不顯著(P＞0.05)，但它們與野生群體及奠基群體間的Fst值差異顯著(P＜0.

21、01)。⑤用UPGMA法和NJ法構(gòu)建的6個團(tuán)頭魴群體的聚類樹基本一致，聚類結(jié)果顯示，六群體團(tuán)頭魴明顯分成兩大支。野生群體（LZ和YN）和奠基群體聚為一支，不同選育后期世代群體(F7，F(xiàn)8和F9)聚為另一支。
　　6.不同倍性團(tuán)頭魴群體遺傳變異的微衛(wèi)星分析
　　以本實(shí)驗(yàn)室所研制的不同倍性團(tuán)頭魴群體（團(tuán)頭魴同源四倍體、倍間正交三倍體、倍間反交三倍體、倍間異源三倍體以及二倍體“浦江1號”）為對象，利用多態(tài)性微衛(wèi)星DNA標(biāo)記研究多倍

22、體育種對魚類遺傳多樣性和遺傳分化可能產(chǎn)生的影響，為闡明某些自然擬四倍體物種（如鯉、虹鱒等）的起源提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果:①17對微衛(wèi)星引物在不同倍性團(tuán)頭魴五群體中探測到的等位基因數(shù)共有115個，大小在102～331bp之間。②不同倍性團(tuán)頭魴五群體內(nèi)的Shannon多樣性指數(shù)在0.2571～0.3842之間，Nei's基因多樣性指數(shù)在0.1680～0.2511之間，平均遺傳距離在0.3443～0.5045之間;五群體間的Nei's標(biāo)準(zhǔn)

23、遺傳距離在0.0504～0.1895之間，成對FST值范圍為0.0548～0.3773，均達(dá)到顯著性水平（P＜0.05），表明不同倍性團(tuán)頭魴各群體間均發(fā)生了顯著的遺傳分化。③Shannon多樣性指數(shù)和Nei's基因多樣性指數(shù)在五群體間的變化趨勢一致，即:同源4n-F1＞反交3n＞正交3n＞2n＞異源3n，而且，同源4n-F1、反交3n以及正交3n群體的Shannon多樣性指數(shù)(SHpop)和Nei's基因多樣性指數(shù)均顯著地(P＜0.05

24、)大于異源3n群體。④對五群體微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳變異的分子方差分析和聚類分析的結(jié)果表明:不同倍性團(tuán)頭魴五群體間出現(xiàn)顯著的遺傳分化，分子系統(tǒng)樹分成明顯的兩支，同源4n-F1、正交3n、反交3n和2n為一支，異源3n為另一支。
　　7.不同倍性團(tuán)頭魴群體遺傳變異的線粒體DNA分析
　　通過對線粒體DNA控制區(qū)和COⅡ基因序列的聯(lián)合分析，進(jìn)一步研究了不同倍性團(tuán)頭魴群體的遺傳多樣性和遺傳分化關(guān)系。結(jié)果表明:①在所分析的1509bp片段中

25、，4種核苷酸(T、C、A、G)的平均含量分別為29.0％、24.1％、31.7％和15.2％。②核苷酸變異類型有轉(zhuǎn)換、顛換、插入/缺失4種。確定了52種單倍型，群體間無共享單倍型，五群體的單倍型多樣度(H)在0.843～0.850之間，說明不同群體內(nèi)單倍型類型豐富。③不同倍性團(tuán)頭魴五群體內(nèi)的核苷酸多樣性指數(shù)（π）在0.193％～0.239％之間，平均核苷酸差異數(shù)(K)在2.843～3.754之間，變異位點(diǎn)數(shù)在23～28之間;五群體之間的

26、雙參數(shù)平均遺傳距離在0.0017～0.0029之間，遺傳分化指數(shù)(FST)在0.0614～0.1494之間。各群體兩兩間均發(fā)生了顯著分化（P＜0.05）。④變異位點(diǎn)數(shù)、單倍型多樣度（H）、核苷酸多樣性指數(shù)(π)及平均核苷酸差異數(shù)(K)這4個遺傳參數(shù)在5個群體間的變化趨勢一致，按從大到小的順序依次為:反交3n＞異源3n＞正交3n＞同源4n-F1＞2n。⑤對線粒體序列變異的分子方差分析和聚類分析的結(jié)果表明:不同倍性團(tuán)頭魴五群體間出現(xiàn)顯著的遺