組胺及抗組胺藥物對單離的豚鼠鼻粘膜纖毛細(xì)胞運(yùn)動的影響.pdf

1、粘液纖毛傳輸功能(mucociliary transport)在呼吸道防衛(wèi)系統(tǒng)中的作用舉足輕重。一個有效的粘液纖毛傳輸系統(tǒng)，依靠正常的纖毛功能，包括纖毛擺動頻率的正常，粘膜結(jié)構(gòu)的完整，細(xì)胞間相互協(xié)調(diào)的一致。粘液纖毛傳輸系統(tǒng)的效率決定于纖毛尖端的相互傳遞和纖毛間的協(xié)同運(yùn)動，而這兩者提高纖毛傳輸系統(tǒng)效率是通過纖毛擺動頻率(ciliary beat frequency，CBF)的加快實現(xiàn)的。因此，CBF是衡量粘膜纖毛傳輸功能的重要參數(shù)。變應(yīng)性

2、鼻炎(Allergic rhinitis，AR)造成大量生物活性介質(zhì)釋放，這些介質(zhì)使鼻粘膜功能損傷，從而導(dǎo)致粘膜傳輸率下降和粘膜表面粘液毯性質(zhì)的變化。所以變應(yīng)性鼻炎是引起鼻竇感染的一個重要病因。因此，患變應(yīng)性鼻炎的病人患鼻竇炎的機(jī)率大大提高。不同的生物活性介質(zhì)對培養(yǎng)的鼻粘膜纖毛細(xì)胞的作用已有較多報道。但是生物活性介質(zhì)對單離纖毛細(xì)胞的作用還沒有得到較為準(zhǔn)確的測量。因此，我們利用單離纖毛細(xì)胞的體外模型，來觀察不同濃度組胺及抗組胺藥物異丙嗪對

3、纖毛擺動頻率的影響。 第一部分、豚鼠鼻粘膜纖毛細(xì)胞的顯微機(jī)械分離和細(xì)胞固定方法的建立 目的：①實驗擬將顯微機(jī)械分離技術(shù)應(yīng)用于豚鼠鼻粘膜纖毛細(xì)胞的分離，為進(jìn)一步實驗提供純凈的目的細(xì)胞；②探索即刻分離的纖毛細(xì)胞的固定方法。 方法：①白色健康豚鼠20只，體重180～500 g，在光學(xué)顯微鏡下用顯微器械將豚鼠鼻粘膜的纖毛細(xì)胞層和粘膜下層進(jìn)行分離，取顯微機(jī)械分離的粘膜和未行分離的全層粘膜行蘇木精-伊紅染色，明確所分離組織層

4、是否為粘膜纖毛細(xì)胞層。再將纖毛細(xì)胞層酶解，低倍鏡下觀察單個鼻粘膜纖毛細(xì)胞(以下簡稱單離纖毛細(xì)胞)個數(shù)，纖毛細(xì)胞團(tuán)大小，雜質(zhì)細(xì)胞個數(shù)。高倍顯微鏡下觀察纖毛細(xì)胞的形態(tài)。②將實驗中得到的纖毛細(xì)胞用玻璃電極負(fù)壓固定，采用數(shù)字化顯微成像技術(shù)通過高速電荷耦合器件(charged coupled device，CCD)攝像機(jī)，每秒可采集1207幀圖像，記錄纖毛運(yùn)動狀況，獲得連續(xù)的數(shù)字圖像并存儲在計算機(jī)硬盤中，然后經(jīng)過計算機(jī)軟件分析每一擺動周期的時間間

5、隔，從而獲得每擺CBF，實現(xiàn)對纖毛擺動狀況的自動化精確測量。 結(jié)果：①蘇木精-伊紅染色見顯微機(jī)械分離的組織層為纖毛細(xì)胞和基底細(xì)胞層，較薄，不含有粘膜下層。低倍顯微鏡下可見顯微機(jī)械分離后纖毛細(xì)胞較密集，單個鼻粘膜纖毛細(xì)胞較多，纖毛細(xì)胞團(tuán)較小，每個細(xì)胞團(tuán)平均有7個纖毛細(xì)胞左右，且纖毛細(xì)胞團(tuán)下面無其他細(xì)胞。高倍顯微鏡下可見顯微機(jī)械分離的單離纖毛細(xì)胞膜光滑，折光性好，纖毛擺動活躍。與傳統(tǒng)分離技術(shù)相比，顯微機(jī)械分離技術(shù)在目的細(xì)胞純度和活性

6、上有顯著優(yōu)勢(P＜0.05)。②電極尖端直徑為2～5μm時，電極內(nèi)壓力為10～20cmH2O柱，纖毛細(xì)胞即可固定較好，無晃動。 結(jié)論：①顯微機(jī)械分離技術(shù)簡單易行，實用性強(qiáng)，可作為分離過程中的一步加以應(yīng)用；②本研究采用的單離細(xì)胞固定技術(shù)可以對纖毛擺動進(jìn)行有效測量。 第二部分、組胺對單離的豚鼠鼻粘膜纖毛細(xì)胞運(yùn)動的影響 目的：檢驗玻璃電極對單離纖毛細(xì)胞的固定是否有效；觀察不同濃度組胺短期刺激對纖毛擺動頻率的影響；細(xì)胞外

7、鈣離子(Ca2+)對纖毛細(xì)胞作用。 方法：將第一部分實驗中得到的纖毛細(xì)胞用玻璃電極負(fù)壓固定，采用數(shù)字化顯微成像技術(shù)通過高速電荷耦合器件(charged coupled device，CCO)攝像機(jī)，每秒可采集120幀圖像，記錄纖毛運(yùn)動狀況，獲得連續(xù)的數(shù)字圖像并存儲在計算機(jī)硬盤中，然后經(jīng)過計算機(jī)軟件分析每一擺動周期的時間間隔，從而獲得每擺CBF，實現(xiàn)對纖毛擺動狀況的自動化精確測量。實驗分有鈣液和無鈣液兩組，每組再將組胺按濃度分為6

8、組(10-6～10-1mol/L)和ATP組。 結(jié)果：①加用組胺1～2min內(nèi)CBF明顯升高并達(dá)到高峰；②隨著時間的延長，10-6mol/L和10-5mol/L濃度組胺組CBF呈下降趨勢，10-4mol/L～10-2mol/L濃度組出現(xiàn)平臺期，且隨濃度的升高，平臺期延長；③組胺濃度達(dá)到10-4mol/L時，纖毛擺動幅度增大，出現(xiàn)不協(xié)調(diào)現(xiàn)象；④再加用ATP可以刺激纖毛細(xì)胞引起CBF再次升高。 結(jié)論：①低濃度組胺(10-6m

9、ol/L和10-3mol/L)可以刺激豚鼠鼻粘膜CBF的升高，并且不影響細(xì)胞的活性；②隨濃度的升高，組胺在升高纖毛細(xì)胞CBF的同時，造成細(xì)胞活性的不同程度的損傷；③10-1mol/L組胺對纖毛細(xì)胞有直接的毒性；④無鈣環(huán)境下細(xì)胞活性差。 第三部分、抗組胺藥物異丙嗪對單離的豚鼠鼻粘膜纖毛細(xì)胞運(yùn)動的影響及對組胺的拮抗作用 目的：觀察抗組胺藥物異丙嗪對單離的豚鼠鼻粘膜纖毛細(xì)胞運(yùn)動的影響及對組胺的拮抗作用。 方法：將第一部

10、分實驗中得到的纖毛細(xì)胞用玻璃電極負(fù)壓固定，采用數(shù)字化顯微成像技術(shù)通過高速電荷耦合器件(charged coupled device，CCD)攝像機(jī)，每秒可采集120幀圖像，記錄纖毛運(yùn)動狀況，獲得連續(xù)的數(shù)字圖像并存儲在計算機(jī)硬盤中，然后經(jīng)過計算機(jī)軟件分析每一擺動周期的時間間隔，從而獲得每擺CBF，實現(xiàn)對纖毛擺動狀況的自動化精確測量。實驗按異丙嗪(Promethazine，PMZ)濃度分為4組(10-6～10-3mol/L)，每組先加用異丙

11、嗪，再加用組胺，最后加用ATP。 結(jié)果：①在加用不同濃度的PMZ1分鐘內(nèi)CBF升高，CBF升高的幅度只是纖毛細(xì)胞最大擺動頻率的50％，各組間無明顯差異；②1μmol/L PMZ組在加藥后第5分鐘CBF下降超過基線頻率，然后CBF逐漸恢復(fù)至基線頻率，纖毛擺動協(xié)調(diào)；③10μmol/L PMZ組在加藥后第10分鐘CBF下降超過基線頻率，然后CBF逐漸恢復(fù)至基線頻率，纖毛擺動協(xié)調(diào)；④100μmol/L PMZ組CBF由峰值逐漸下降在第2

12、0分鐘時CBF到達(dá)基線，纖毛擺動不協(xié)調(diào)；⑤不同濃度的PMZ組再次加組胺后CBF升高，各組峰值無差異；但明顯低于第二部分各組組胺峰值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；⑥不同濃度的PMZ組加組胺后，再加用ATP后CBF升高，各組峰值無差異，但明顯低于Hank’s液ATP組峰值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 結(jié)論：①PMZ可以使CBF溫和的升高；②PMZ對纖毛細(xì)胞的影響過程是：興奮→抑制→恢復(fù)；③PMZ的抑制作用是在興奮作用之