真核表達載體pEGFP-C2-GATA-4的構(gòu)建及其在P19細胞中的表達.pdf

1、目的：移植不同來源的干細胞以修復(fù)梗死的心肌組織、改善心功能已成為目前研究的熱點。雖然人們已成功地將非心源性的干細胞(如胚胎干細胞、造血干細胞和骨骼肌衛(wèi)星細胞等)，移植至梗死的心肌區(qū)域并觀察到它們分化成心肌樣細胞，但是對于這一橫向分化的具體機制所知甚少。目前移植技術(shù)的發(fā)展，體內(nèi)外調(diào)控干細胞向心肌定向分化的因素和作用機制的探討均提示：通過移植干細胞再生心肌以治療心肌梗死疾病已經(jīng)具有一定的理論基礎(chǔ)而且擁有廣闊的應(yīng)用前景。目前尚需進一步研究明確

2、干細胞向心肌細胞的定向分化調(diào)控因素與機制，以提高干細胞的心肌分化，加速干細胞安全可靠地應(yīng)用于臨床。 GATA-4是胚胎期心臟發(fā)生發(fā)育過程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，參與心臟前體細胞的分化、心臟的環(huán)化、房室分隔、傳導(dǎo)系統(tǒng)及成熟心臟正常功能的維持。GATA-4主要通過其特有的鋅指結(jié)構(gòu)在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，當(dāng)GATA-4基因發(fā)生缺失或突變時就會引起各種心臟疾病。GATA-4因子是心臟前體細胞的最早期標(biāo)志之一，對于心臟發(fā)育是必不可少

3、的。GATA-4因子首先在心前期中胚層中表達，隨后在心內(nèi)膜和心肌中表達。GATA-4因子調(diào)節(jié)心肌細胞的發(fā)生、分化以及心肌前體細胞形成線狀心管。GATA-4的表達對心肌細胞標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄和表達至關(guān)重要。P19胚胎癌細胞(embryorlal carcinoma cells,EC)經(jīng)誘導(dǎo)可分化為包括心肌在內(nèi)的多種細胞，在P19細胞向心肌分化的過程中，其細胞發(fā)育相關(guān)基因的表達及電生理特性與正常小鼠心肌發(fā)育過程相似，且該細胞易于進行基因操作，是研

4、究心肌細胞發(fā)育的良好體外模型。 為進一步研究轉(zhuǎn)錄因子GATA-4在心臟發(fā)育及心肌分化中的作用，本研究構(gòu)建了含有小鼠GATA-4編碼框的pEGFP-C2-GATA-4真核表達載體，并在P19細胞中瞬時表達成功，為進一步研究心特異轉(zhuǎn)錄因子的功能及調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。 方法：1、以真核表達質(zhì)粒pEFSA-GATA-4為模板，PCR擴增得到小鼠GATA-4基因片段，將目的片段亞克隆到pEGFP-C2載體，卡那霉素篩選陽性克隆，經(jīng)

5、菌落PCR、酶切鑒定和測序鑒定正確。2、將重組質(zhì)粒pEGFP-C2-GATA4以脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染P19細胞，以免疫細胞化學(xué)、共聚焦掃描顯微鏡、PCR、免疫印記法檢測GATA-4-EGFP融合蛋白在P19細胞中的表達。 結(jié)果：1、經(jīng)PCR獲得 1325bp 的產(chǎn)物，經(jīng)酶切、DNA測序，確定所擴增片段為GATA-4基因cDNA，進而成功篩選出表達載體pEGFP-C2-GATA-4。2、轉(zhuǎn)染后的P19細胞中通過免疫細胞化學(xué)，RT-PC

6、R，Western blot等方法分別從基因和蛋白水平證明P19細胞中有GATA-4基因的表達。 結(jié)論：獲得編碼GATA-4的基因片段，并成功構(gòu)建了其真核表達載體pEGFP-C2-GATA-4。在其轉(zhuǎn)染的P19細胞中有GATA-4基因表達。GATA-4基因cDNA真核表達載體的成功構(gòu)建以及在P19細胞中的表達的特點顯示了極具意義義的潛在應(yīng)用價值。心臟發(fā)育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是個極其復(fù)雜的過程，是一個多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與的聯(lián)合協(xié)同運作的網(wǎng)