大腸桿菌O157∶H7的高靈敏度快速檢測(cè)方法的研究.pdf

1、大腸桿菌(E．Coli)0157:H7感染性腹瀉是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的危害嚴(yán)重的腸道傳染病。自1982年美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)該病以來(lái)，先后在日本等40多個(gè)國(guó)家有不同程度的暴發(fā)流行，死率較高。大腸桿菌0157:H7的感染已成為世界性的問(wèn)題。世界衛(wèi)生組織已將其列入新的食源性疾病的病原菌。目前，檢測(cè)大腸桿菌0157:H7的方法很多，但是大多方法存在時(shí)間較長(zhǎng)，需要一些特殊的儀器設(shè)備，或準(zhǔn)確率不夠高的缺點(diǎn)。因此尋找一種便捷靈敏的檢測(cè)大腸桿菌0157:H7的方法

2、對(duì)相關(guān)疾病的預(yù)防和治療十分重要。
　　 本研究首先利用免疫磁珠富集大腸桿菌0157:H7菌體，即選擇1μm和200nm兩種不同尺度的磁珠，研究磁珠的大小和濃度對(duì)富集效率的影響，篩選并確定出最佳的反應(yīng)條件為:1.2μL的200nm的磁珠富集lmL的10的大腸桿菌0157:H7(OD600=1.0～1.2)的稀釋液時(shí)，富集效率最佳。并且有效地濃縮了檢測(cè)樣品中大腸桿菌0157:H7的濃度。
　　 將富集好的菌體用自研的磁珠法提

3、取大腸桿菌0157:H7的基因組DNA，依據(jù)高鹽離子濃度下多聚核苷酸與羧基修飾的磁珠表面會(huì)發(fā)生非特異吸附，而蛋白、單糖、多糖和脂類等細(xì)胞成分不被吸附的原理，建立一種以磁性微珠為載體的簡(jiǎn)單快速的細(xì)菌基因組DNA純化方法，可在7min內(nèi)完成整個(gè)提取過(guò)程，簡(jiǎn)便易于操作。之后用環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)檢測(cè)大腸桿菌0157:H7的DNA，優(yōu)化反應(yīng)條件，最終使檢測(cè)靈敏度高達(dá)30CFU/mL。LAMP反應(yīng)是對(duì)靶基因的6或8個(gè)特異部位設(shè)定4或6

4、種引物，利用具有鏈置換活性的BStDNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從而使靶基因高效擴(kuò)增。LAMP較PCR方法時(shí)間更短，操作更簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)，靈敏度提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。
　　 本研究將免疫磁珠技術(shù)、磁珠提取DNA技術(shù)和LAMP反應(yīng)檢測(cè)大腸桿菌0157:H7有機(jī)結(jié)合，整個(gè)流程操作簡(jiǎn)便易行，不需要任何的大型的儀器，可在70min內(nèi)完成。本法是一種高靈敏快速檢測(cè)大腸桿菌0157:H7的簡(jiǎn)便方法，并為其檢測(cè)自動(dòng)化奠定了一定的基礎(chǔ)，也可