阿托伐他汀和普伐他汀對醛固酮誘導心臟成纖維細胞ET-1-ET-AR和TGF-β1-TGF-βRI系統(tǒng)表達的影響及其信號轉導機制的研究.pdf

1、本研究以培養(yǎng)的新生SD大鼠心臟成纖維細胞為研究靶細胞，采用放射免疫分析法、ELISA、流式細胞術、Western Blot和RT-PCR 技術動態(tài)觀察了醛固酮誘導的心臟成纖維細胞的ET-1/ET-AR和TGF-β1/TGF-βRⅠ系統(tǒng)表達的變化；同時觀察HMG-CoA還原酶抑制劑(阿托伐他汀和普伐他汀)對醛固酮誘導的心臟成纖維細胞 ET-1/ET-AR和TGF-β1/TGF-βRⅠ系統(tǒng)表達的影響；還應用Western blot技術測定心

2、臟成纖維細胞p44/42MAPK蛋白的表達，探討了阿托伐他汀、普伐他汀和醛固酮干預下心臟成纖維細胞。p44/42 MAPK信號轉導通路的變化。因此，本實驗從mRNA表達、蛋白質合成和分泌水平初步探討了阿托伐他汀、普伐他汀和醛固酮誘導大鼠心臟成纖維細胞ET-1/ET-AR和TGF-β1/TGF-βRⅠ系統(tǒng)表達的影響，了解其細胞分子生物學機制及其信號轉導通路，為闡明心肌纖維化的發(fā)生機制，防治心肌纖維化提供新的思路和實驗依據。 實驗內

3、容主要包括以下五部分： 第一部分：醛固酮對心臟成纖維細胞ET-1/ET-AR系統(tǒng)表達的影響 目的：醛固酮對新生大鼠心臟成纖維細胞ET-1/ET-AR系統(tǒng)表達的影響及其可能的作用機制。 方法：采用放射免疫分析法測定心臟成纖維細胞細胞培養(yǎng)液中的ET，流式細胞術檢測心臟成纖維細胞ET-1，半定量RT-PCR 技術檢測心臟成纖維細胞ppET-1和ET-AR tuRNA表達的變化。 結果：1．醛固酮劑量依賴性誘導心

4、臟成纖維細胞培養(yǎng)液中ET水平的增加及螺內酯的抑制作用：與正常對照組相比，醛固酮(10<'-9>、10<'-8>和10<'-7>mol/L)作用心臟成纖維細胞48 h，培養(yǎng)液中ET的水平明顯增加，且呈劑量依賴性(P<0.05、P<0.01和P<0.01)。以螺內酯(10<'-6>mol/L)預處理心臟成纖維細胞2 h后，再加入醛固酮(10<'-7>mol/L)作用48 h后，培養(yǎng)液中ET 的水平與對照組相比無明顯差異；同時，單獨使用螺內酯

5、(10<'-6>mol/L)并不改變培養(yǎng)液中ET的水平。 2．醛固酮劑量依賴性誘導心臟成纖維細胞中ET-1含量的增加及螺內酯的抑制作用：與正常對照組相比，醛固酮(10<'-9>、10<'-8>和10<'-7>mol/L)作用心臟成纖維細胞24 h，心臟成纖維細胞中ET-1的含量明顯增加，且呈劑量依賴性(P<0.05、P<0.01和．P<0.01)；以螺內酯(10<'-6>mol/L)預處理心臟成纖維細胞2 h后，再加入醛固酮(1

6、0<'-7>mol/L)作用24 h后，心臟成纖維細胞中ET-1表達與對照組相比無明顯差異；同時，單獨使用螺內酯(10<'-6>mol/L)并不改變心臟成纖維細胞中ET-1的表達。 3．醛固酮誘導心臟成纖維細胞ppET-1 mRNA表達的時間效應：在1％牛血清白蛋白心臟成纖維細胞培養(yǎng)液中加入醛固酮(10<'-7>mol/L)后0、1、2、4、和8 h，分別測定ppET-1 mRNA表達水平。結果顯示：在2 h時，ppET-1mR

7、NA表達明顯增加(P<0.01)，4 h達高峰(P<0.01)，以后逐漸下降。 4．醛固酮劑量依賴性誘導心臟成纖維細胞ppET-1 mRNA的表達及螺內酯的抑制作用：與正常對照組相比，醛固酮(10<'-9>、10<'-8>和10<'-7>mol/L)作用心臟成纖維細胞4 h，ppET-1 mRNA表達明顯增加，且呈劑量依賴性(P<0.05、P<0.01和P<0.01)；以螺內酯(10<'-6>mol/L)預處理心臟成纖維細胞2

8、h后，再加入醛固酮(10<'-7>mol/L)作用4 h后，ppET-1 mRNA表達與醛固酮(10<'-7>mol/L)組相比顯著降低，而與對照組相比無明顯差異；同時，單獨使用螺內酯(10<'-6>mol/L)并不改變ppET-1 mRNA的表達。 5．醛固酮對心臟成纖維細胞ET-AR mRNA表達的時間過程：在1％牛血清白蛋白培養(yǎng)的心臟成纖維細胞培養(yǎng)液中加入醛固酮(10<'-7>mol/L)后0、1、2、4和8 h，分別測定

9、ET-AR mRNA表達水平。結果顯示：在正常對照組(0 h)心臟成纖維細胞表達少量的：ET-AR mRNA。給予醛固酮1 h后，ET-AR mRNA的表達無明顯變化，而2 h后，ET-AR mRNA表達開始增加，4 h達高峰(P<0.01)，8 h的時候較4 h組明顯降低，但仍高于對照組水平。 6．醛固酮劑量依賴性誘導心臟成纖維細胞ET-AR mRNA的表達及螺內酯的抑制作用：與正常對照組相比，醛固酮(10<'-9>、10<'

10、-8>和10<'-7>mol/L)作用心臟成纖維細胞4 h，ET-AR mRNA表達明顯增加，且呈劑量依賴性(P<0.05、P<0.01和P<0.01)；以螺內酯(10<'-6>mol/L)預處理心臟成纖維細胞2 h后，再加入醛固酮(10<'-7>mol/L)作用4 h后，ET-AR tuRNA表達與醛固酮(10<'-7>mol/L)組相比顯著降低，而與對照組相比無明顯差異；同時，單獨使用螺內酯(10<'-6>mol/L)并不改變ET-

11、AR mRNA的表達。 結論：醛固酮劑量依賴性上調心臟成纖維細胞的ET-1/ET-AR系統(tǒng)的表達，且此作用可能是通過MR受體介導的。 第二部分：醛固酮對心臟成纖維細胞 TGF-β1/TGF-βR Ⅰ系統(tǒng)表達的影響 目的：醛固酮對新生大鼠心臟成纖維細胞 TGF-β1/TGF-βR Ⅰ系統(tǒng)表達的影響及其可能的作用機制。 方法：應用ELISA測定心臟成纖維細胞細胞培養(yǎng)液中的TGF-β1，Westem blot檢

12、測心臟成纖維細胞 TGF-β1，半定量RT-PCR技術檢測心臟成纖維細胞TGF-β1和TGF-βR Ⅰ mRNA表達的變化。 結論：醛固酮劑量依賴性上調心臟成纖維細胞的TGF-β1/TGFβRⅠ系統(tǒng)的表達，且此作用可能是通過MR受體介導的。 第三部分：阿托伐他汀和普伐他汀對醛固酮誘導心臟成纖維細胞ET-1/ET-AR系統(tǒng)表達的影響 目的：探討阿托伐他汀和普伐他汀對醛固酮誘導的心臟成纖維細胞的ET-1/ET-AR

13、系統(tǒng)表達的影響及其可能的作用機制。 方法：采用放射免疫分析法測定心臟成纖維細胞細胞培養(yǎng)液中的ET，流式細胞術檢測心臟成纖維細胞ET-1，半定量RT-PCR技術檢測心臟成纖維細胞ppET-1和ET-AR mRNA表達的變化。 結論：阿托伐他汀和普伐他汀劑量依賴性下調醛固酮誘導心臟成纖維細胞ET-1/ET-AR 系統(tǒng)的表達，其機制可能與甲羥戊酸代謝途徑有關。 第四部分：阿托伐他汀和普伐他汀對醛固酮誘導的心臟成纖維細胞

14、TGF-β1/TGF-βR Ⅰ系統(tǒng)表達的影響 目的：探討阿托伐他汀和普伐他汀對醛固酮誘導的心臟成纖維細胞的TGF-β1/TGF-βR Ⅰ系統(tǒng)表達的影響及其可能的作用機制。 方法：應用ELISA測定心臟成纖維細胞細胞培養(yǎng)液中的TGF-β1，Westem blot檢測心臟成纖維細胞 TGF-β1，半定量RT-PCR技術檢測心臟成纖維細胞TGF-β1和TGF-βR Ⅰ mRNA表達的變化。 結論：阿托伐他汀和普伐他汀劑

15、量依賴性下調醛固酮誘導心臟成纖維細胞 TGF-β1/TGF-βRⅠ系統(tǒng)的表達，其機制可能與甲羥戊酸代謝途徑有關。 第五部分：p44/42 MAPK信號轉導系統(tǒng)在心臟成纖維細胞 ET和TGF-β1分泌中的作用 目的：探討p44/42 MAPK 信號轉導系統(tǒng)在心臟成纖維細胞 ET 和ET和TGF-β1分泌中的作用。 方法：采用放射免疫分析法和ELISA分別測定心臟成纖維細胞細胞培養(yǎng)液中的。ET和 ET和TGF-β1，

16、Western blot 技術檢測心臟成纖維細胞 p44/42MAPK和磷酸化p44/42 MAPK蛋白含量的變化。 結論：醛固酮能通過MR活化新生大鼠心臟成纖維細胞的p44/42 MAPK，誘導ET和TGF-β1表達；阿托伐他汀和普伐他汀可能通過甲羥戊酸代謝途徑下調醛固酮誘導的心臟成纖維細胞p44/42 MAPK的活化水平，抑制醛固酮誘導的心臟成纖維細胞ET和TGF-β1的分泌，從而減緩心肌纖維化。從分子水平探討了p44/42