FAT10功能域的活性分析.pdf

1、類泛素蛋白家族是一類結(jié)構(gòu)域與泛素有很高同源性的小分子量蛋白，對細胞的生長調(diào)控起著多種重要作用。FAT10又被稱為雙泛素，是類泛素家族的成員之一。FAT10主要表達在胎盤、胸腺、脾、淋巴結(jié)，胚胎等與免疫系統(tǒng)功能密切相關(guān)的組織中。胃腸癌、肝癌、子宮癌、宮頸癌、卵巢癌等多種癌癥中，F(xiàn)AT10也存在過表達現(xiàn)象。FAT10與抑癌基因p53關(guān)系密切，并參與細胞凋亡調(diào)控，研究表明FAT10以類似泛素的方式與底物蛋白質(zhì)共價連接，并促進其降解，但具體調(diào)控

2、機制尚不清楚。因此，對FAT10結(jié)構(gòu)與功能的活性研究，可以進一步深入了解FAT10在細胞周期調(diào)控以及癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的作用，為癌癥的臨床治療提供新的策略。
　　在本研究中，我們以人類胸腺cDNA文庫為模板，成功擴增了FAT10的全長開放閱讀框，并將其構(gòu)建到哺乳動物表達載體pCMV-HA中獲得pCMV-HA-FAT10重組質(zhì)粒。并進一步構(gòu)建FAT10的N端及C端泛素結(jié)構(gòu)域，以及FAT10末端雙甘氨酸基團突變的FAT10△GG于pC

3、MV-HA真核表達載體，成功表達出FAT10-HA，F(xiàn)AT10-N-HA,FAT10-C-HA，F(xiàn)AT10△GG-HA融合蛋白。我們將FAT10及各突變體瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，并使用26S蛋白酶體抑制劑MG132處理，通過Western Blotting實驗檢測野生型FAT10及其突變體結(jié)合底物蛋白質(zhì)的活性，發(fā)現(xiàn)FAT10的C末端雙甘氨酸基團以及雙泛素結(jié)構(gòu)域都是FAT10與底物共價結(jié)合所需的活性基團，被FAT10標記后的底物蛋白質(zhì)

4、通過26S蛋白酶體途徑降解。為了進一步檢測FAT10及其N、C端結(jié)構(gòu)域降解底物蛋白質(zhì)的活性，我們成功構(gòu)建并表達了FAT10及其獨立的雙泛素結(jié)構(gòu)域標記在EGFP蛋白質(zhì)N末端的融合蛋白，并通過Cycloheximide chase反應(yīng)檢測FAT10極其截斷突變體對EGFP降解的影響。發(fā)現(xiàn)FAT10極其雙泛素結(jié)構(gòu)域都具有促進EGFP降解的活性。我們又通過Annexin-Ⅴ細胞凋亡檢測方法檢驗了FAT10極其截斷突變體對細胞凋亡活性的影響，發(fā)現(xiàn)