FAT10調(diào)控survivin泛素化降解在膀胱癌增殖中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的：膀胱癌（BC）是我國最常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均占泌尿系統(tǒng)腫瘤的首位。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的一個(gè)重要途徑，F(xiàn)AT10是唯一能直接介導(dǎo)蛋白酶體降解途徑的類泛素蛋白，在調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)功能方面發(fā)揮重要作用。Survivin屬于凋亡抑制蛋白家族（IAPs）的成員，具有抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及增加細(xì)胞增殖的能力。
　　本研究主要探討膀胱癌組織及膀胱癌細(xì)胞中FAT10

2、和survivin的表達(dá)，分析兩者表達(dá)水平之間的關(guān)系及其臨床意義；研究FAT10通過調(diào)控survivin的表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖的影響及其具體機(jī)制。
　　方法：
　　1、選取隨訪5年以上資料完整的膀胱癌患者133例，免疫組化檢測(cè)FAT10和survivin在膀胱癌組織石蠟塊中的表達(dá)情況，分析FAT10和survivin表達(dá)的相關(guān)性、并分析其與患者的臨床病理資料及預(yù)后的關(guān)系。
　　2、收集50例膀胱癌患者的膀胱癌組織及癌旁

3、組織，通過熒光定量PCR、Western blot檢測(cè)膀胱癌組織和癌旁組織中FAT10和survivin的表達(dá)情況，并分析兩者表達(dá)是否存在相關(guān)性。
　　3、通過熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞T24、J82、5637、UM-UC-3及正常細(xì)胞株人輸尿管上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1中FAT10和survivin的mRNA和蛋白表達(dá)情況。
　　4、構(gòu)建了4個(gè)shFAT10干擾質(zhì)粒，并將我們構(gòu)建的4干擾質(zhì)粒

4、轉(zhuǎn)染至膀胱癌細(xì)胞，利用熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后FAT10的表達(dá)變化，篩選出shFAT10最佳干擾質(zhì)粒；將篩選出的最佳shFAT10干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到膀胱癌5637細(xì)胞中，運(yùn)用Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后細(xì)胞中FAT10和survivin蛋白表達(dá)變化，運(yùn)用EdU實(shí)驗(yàn)觀察干擾FAT10后膀胱癌細(xì)胞增殖能力的變化；將過表達(dá)FAT10質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到膀胱癌UM-UC-3細(xì)胞中，運(yùn)用Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)

5、染48h后細(xì)胞中FAT10和survivin蛋白表達(dá)變化，運(yùn)用EdU實(shí)驗(yàn)觀察過表達(dá)FAT10后膀胱癌細(xì)胞增殖能力的變化；利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shFAT10的膀胱癌細(xì)胞株建立人膀胱癌裸鼠皮下瘤模型，觀察裸鼠腫瘤的生長情況。
　　5、構(gòu)建了4個(gè)shsurvivin干擾質(zhì)粒，并將我們構(gòu)建的4個(gè)干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至膀胱癌細(xì)胞，利用熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后survivin蛋白和mRNA的表達(dá)變化,篩選出shsurvivin

6、最佳干擾質(zhì)粒；在膀胱癌細(xì)胞中降低FAT10的同時(shí)增加survivin的表達(dá)及在膀胱癌細(xì)胞中增加FAT10的同時(shí)干擾survivin的表達(dá)，利用EdU實(shí)驗(yàn)觀察膀胱癌細(xì)胞增殖能力的變化。
　　6、利用免疫共沉淀、激光共聚焦及體外泛素化實(shí)驗(yàn)等方法明確FAT10通過調(diào)控survivin的泛素化降解穩(wěn)定survivin表達(dá)的具體機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1、免疫組化顯示133例膀胱癌組織中FAT10的陽性率為52.6％，Survi

7、vin的陽性率為56.4%，且兩者的表達(dá)呈正相關(guān)；熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)50例膀胱癌組織及癌旁組織中FAT10及survivin的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌組織中FAT10和survivin mRNA及蛋白的表達(dá)明顯高于癌旁組織，通過散點(diǎn)圖分析發(fā)現(xiàn)FAT10與survivin呈正相關(guān)；通過熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)四株膀胱癌細(xì)胞和正常細(xì)胞株人輸尿管上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1中FAT10和survivin

8、的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有膀胱癌細(xì)胞株中的FAT10和 survivin的表達(dá)明顯高于正常細(xì)胞株人輸尿管上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1，且其表達(dá)趨勢(shì)較一致；FAT10和survivin的表達(dá)與患者的腫瘤分期有關(guān)，F(xiàn)AT10陽性表達(dá)組和survivin陽性表達(dá)組患者的總生存期及無疾病生存期5年生存率低于陰性表達(dá)組，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；將患者FAT10和survivin的表達(dá)分為四類：FAT10(-)survivin(-)，F(xiàn)AT10(

9、+)survivin(-)，F(xiàn)AT10(-)survivin(+)，F(xiàn)AT10(+)survivin(+)，結(jié)果顯示FAT10(+)survivin(+)組對(duì)應(yīng)的平均生存時(shí)間最短；多因素Cox回歸分析顯示腫瘤分級(jí)為影響預(yù)后獨(dú)立的影響因素。
　　2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shFAT10質(zhì)粒的膀胱癌細(xì)胞5637中，F(xiàn)AT10蛋白表達(dá)明顯下降，同時(shí)survivin蛋白的表達(dá)也隨之減少，EdU實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)膀胱癌細(xì)胞5637中 shFAT10組的增殖能力比s

10、hNC組明顯降低；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達(dá)FAT10質(zhì)粒的膀胱癌細(xì)胞UM-UC-3中， FAT10蛋白表達(dá)明顯升高，同時(shí)survivin蛋白的表達(dá)也隨之增加，EdU實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)FAT10可以明顯增加UM-UC-3細(xì)胞的增殖能力；利用人膀胱癌裸鼠皮下腫瘤模型發(fā)現(xiàn)shFAT10組的裸鼠成瘤體積明顯小于shNC組，瘤體的重量也明顯小于空載質(zhì)粒對(duì)照組。
　　3、轉(zhuǎn)染 shFAT10至5637細(xì)胞后發(fā)現(xiàn) survivin表達(dá)下降，而轉(zhuǎn)染GV141-

11、Survivin至穩(wěn)定干擾FAT10的5637細(xì)胞中可以恢復(fù)survivin的表達(dá)，增殖能力明顯升高；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（-）myc-His-FAT10至UM-UC-3細(xì)胞后，Survivin表達(dá)升高，而轉(zhuǎn)染shsurvivin至穩(wěn)定高表達(dá)FAT10的UM-UC-3細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)survivin的表達(dá)下降，且增殖能力明顯下降。表明survivin是FAT10調(diào)節(jié)膀胱癌增殖的關(guān)鍵效應(yīng)分子。
　　4、免疫共沉淀及激光共聚焦發(fā)現(xiàn)survi