淋球菌外膜蛋白NspA和耐輻射奇球菌SOD基因的克隆和在乳酸菌中表達(dá)的初步研究.pdf

1、運(yùn)用乳酸菌胞內(nèi)表達(dá)載體pMG36e和分泌表達(dá)載體pVE5523，構(gòu)建淋病奈瑟菌表面蛋白A(Neisseria surface protein A，NspA)和耐輻射奇球菌錳超氧化物歧化酶(Mn superoxide dismutase，Mn-SOD)兩種目的基因的表達(dá)重組子，將重組子經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌，初步研究乳酸乳球菌表達(dá)融合NspA和SOD的情況，為篩選目的基因的乳酸菌表達(dá)載體提供依據(jù)和思路；為后續(xù)開(kāi)發(fā)淋球菌外膜蛋白的乳酸菌雙功

2、能活菌疫苗提供參考；為進(jìn)一步研究SOD的表達(dá)對(duì)乳酸菌生物學(xué)特性的影響、開(kāi)發(fā)可直接食用型SODU產(chǎn)品或微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。 方法 本研究?jī)?nèi)容分兩部分： 1．pMG36e-nspA和pMG36e-sod重組子的構(gòu)建和在乳酸菌中表達(dá) 1)優(yōu)化CTAB法提取淋球菌和耐輻射奇球菌基因組的條件；設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化PCR 擴(kuò)增目的基因nspA和sod的條件；目的基因分別與乳酸菌胞內(nèi)表達(dá)載體pMG36e連接，構(gòu)建表達(dá)重組子p

3、MG36e-nspA和pMG36e-sod，將表達(dá)重組子轉(zhuǎn)化E coli DH5a，利用紅霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆，質(zhì)粒小量提取后，雙酶切和測(cè)序鑒定。 2)優(yōu)化乳酸乳球菌MGl363感受態(tài)細(xì)胞制作和重組質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化該細(xì)胞的條件；將鑒定正確的表達(dá)重組子分別經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化MGl363感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)SDS．PAGE、Western blot、SOD活性測(cè)定等方法，初步研究重組菌MGl363-pMG36e-nspA和MGl363-pMG3

4、6e-sod表達(dá)融合NspA和融合SOD的情況。 2．pVE5523-nspA和pVE5523-sod重組子的構(gòu)建和在乳酸菌中表達(dá)的初步研究 1)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增目的基因nspA和sod，然后分別與乳酸菌分泌表達(dá)載體pVE5523連接，構(gòu)建表達(dá)重組子pVE5523-nspA和pVE5523-sod，將表達(dá)重組子轉(zhuǎn)化E coli JMl09，利用紅霉素和氨卞青霉素兩種抗性篩選陽(yáng)性克隆，質(zhì)粒小量提取后，雙酶切鑒定。

5、 2)將鑒定正確的表達(dá)重組子分別經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化MGl363感受態(tài)細(xì)胞，初步分析重組菌MGl363-pVE5523-nspA和MGl363-pVE5523-sod分泌表達(dá)融合NspA和融合SOD的情況。 結(jié)果 1．得到優(yōu)化的以下條件：CTAB法提取淋球菌和耐輻射奇球菌基因組、PCR擴(kuò)增目的基因、乳酸乳球菌MGl363感受態(tài)細(xì)胞的制作以及重組子電穿孔轉(zhuǎn)化該細(xì)胞的條件。 2．成功構(gòu)建了兩套目的基因nspA和sod的

6、乳酸菌表達(dá)重組子pMG36e-nspA、pMG36e-sod和pVE5523-nspA、pVE5523-sod。 3．將鑒定正確的pMG36e-nspA和pMG36e-sod表達(dá)重組子經(jīng)電穿孔高效率轉(zhuǎn)化MGl363感受態(tài)細(xì)胞，重組菌MGl363．pMG36e-sod胞內(nèi)SOD的比活性是272.36U／mg pro，載體對(duì)照菌MGl363-pMG36e胞內(nèi)SOD的比活性是52.42 U／mg pro，表明融合SOD胞內(nèi)表達(dá)成功，但

7、表達(dá)量還不高。SDS-PAGE、Westem b10t分析結(jié)果未能檢測(cè)到NspA融合蛋白的表達(dá)條帶，提示該載體可能不適宜表達(dá)該膜蛋白，迫切需要尋求新的乳酸菌表達(dá)載體。 4．將鑒定正確的pVE5523-nspA和pVE5523-sod表達(dá)重組子經(jīng)電穿孔高效率轉(zhuǎn)化MGl363感受態(tài)細(xì)胞。重組菌MGl363-pVE5523-sod上清液中SOD的比活性是2135.6 U／mg pro，載體對(duì)照菌MGl363-pVE5523上清液中SO

8、D的比活性是266.1 U／mg pro，表明融合SOD分泌表達(dá)成功且具有較高活性。但沉淀上清液中蛋白質(zhì)的條件以及Western blot檢測(cè)MGl363-pVE5523-nspA上清液中融合NspA表達(dá)情況的條件還有待進(jìn)一步優(yōu)化。 結(jié)論 本研究選取淋球菌外膜蛋白NspA和耐輻射奇球菌SOD為目的基因，成功將它們克隆于乳酸菌表達(dá)載體pMG36e和pVE5523，初步研究乳酸乳球菌表達(dá)這兩種目的基因的情況。結(jié)果顯示，具有酶